背景[1-3]
DNA修复蛋白RAD23抗体是一类可以特异性结合DNA修复蛋白RAD23的一类多克隆抗体，主要用于检测DNA修复蛋白RAD23的ELISA实验。
检测原理：双抗体夹心法测定标本中DNA修复蛋白RAD23的水平。用纯化的DNA修复蛋白RAD23抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入DNA修复蛋白RAD23，再与HRP标记的DNA修复蛋白RAD23抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的DNA修复蛋白RAD23呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中DNA修复蛋白RAD23浓度。
DNA是生物体内携带遗传信息的重要物质,由于自身结构的特殊性和外界环境的影响,DNA在复制过程中必然会受到各种损伤从而需要细胞进行修复。研究DNA损伤修复机制,可以使人们更准确地理解生物稳定其遗传信息的机理,更深入地了解基因突变与进化的分子过程。核酸切除修复(NER)途径是生物体内DNA损伤的主要修复方式,Rad23基因、Rad4基因等是该NER途径中具有重要功能的修复因子。已有的研究发现Rad23基因在单细胞的低等生物(酵母)和高等哺乳生物细胞(人类)中对造成DNA损伤的紫外射线等外界因素的响应机制存在差异。
应用[4][5]
用于家蚕核酸切除修复相关基因的克隆与功能分析
利用RT-PCR和RACE技术克隆了家蚕BmRad23基因和BmRad4基因,并对BmRad23基因的功能做了研究,具体研究结果如下：
(1) 利用电子与实验克隆相结合的方法,成功克隆了家蚕BmRad23基因,BmRad23 cDNA全长序列由1304 bp碱基组成,5’UTR和3’UTR分别为165bp、164bp,ORF长975bp,编码324个氨基酸。利用生物信息学的方法解析氨基酸序列的结构与功能域信息,BmRad23氨基酸序列分别包含有UbL(1-74位氨基酸)、两个UBA(135-172、282-319位氨基酸)功能域以及一个XPC结合位点。
(2) 构建了pET28a/BmRad23表达载体,在大肠杆菌中成功表达了BmRad23蛋白,纯化后的BmRad23蛋白作为抗原免疫新西兰兔,得到了特异性良好的多克隆抗体。
(3) 通过Northern blot、Western blot技术对BmRad23基因组织表达特异性和时期表达特异性进行了分析,发现BmRad23基因在家蚕精、卵巢中表达量明显偏高,推测BmRad23在5龄后期幼虫精巢、卵巢中表达量的增加是由于生殖细胞减数分裂的原因造成的。
此结果表明：BmRad23具有与其它物种Rad23在细胞减数分裂中发挥重要功能相似特性,在细胞减数分裂等组织细胞重要发肓时期发挥关键作用。
此外,BmRad23在家蚕变态时期(预蛹期与蛹期)的丝腺中表达量增高,因BmRad23具有UBL/UBA功能域,在变态期组织蛋白质的降解过程中具有起到运送目的蛋白和控制蛋白降解过程的作用。
因此BmRad23在家蚕变态期的组织细胞凋亡、蛋白质降解过程中也具有重要功能,是调节和控制蛋白降解的一个关键因素。
参考文献
[1]Some autophagic and apoptotic features of programmed cell death in the anterior silk glands of the silkworm,Bombyx mori[J].Ebru Goncu,Osman Parlak.Autophagy.2008(8)
[2]Rad33,a new factor involved in nucleotide excision repair in Saccharomyces cerevisae[J].Ben den Dulk,Su Ming Sun,Martina de Ruijter,Jourica A.Brandsma,Jaap Brouwer.DNA Repair.2006(6)
[3]A concise review of DNA damage checkpoints and repair in mammalian cells[J].Jaco H.Houtgraaf,Jorie Versmissen,Wim J.van der Giessen.Cardiovascular Revascularization Medicine.2006(3)
[4]The UBA2 Domain Functions as an Intrinsic Stabilization Signal that Protects Rad23 from Proteasomal Degradation[J].Stijn Heessen,Maria G.Masucci,Nico P.Dantuma.Molecular Cell.2005(2)
[5]徐和平.家蚕核酸切除修复相关基因的克隆与功能分析[D].浙江大学,2009.