背景[1-3]
LIMK1抗体是一种可以特异性结合CCT2的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的CCT2蛋白。LIMK-1单克隆抗体适用于Western印迹(WB)、免疫沉淀(IP)、免疫荧光(IF)、石蜡包埋切片免疫组化(IHCP)、流式细胞术(FCM)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。LIMK-1或LIM结构域激酶1是肌动蛋白动力学的重要调节因子，在细胞运动、增殖和存活中发挥着重要作用。通过磷酸化cofilin，LIMK-1可调节肌动蛋白丝的周转，这对包括迁移和形态在内的各种细胞功能至关重要。包括癌症和神经退行性疾病在内的多种疾病都与LIMK-1的失调有关，因此LIMK-1成为治疗研究的一个重要靶点。
LIMK1抗体
CCT2抗体使用步骤（Western Blot）：
1.样本制备
1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。
2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。
3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
2.蛋白电泳
1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。
2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。
3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。
5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。
6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。
3.转膜与封闭
1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。
2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。
3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。
4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。
5）转膜结束后，切断电源，取出膜。
6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。
7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。
8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。
9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。
10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。
11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。
4.抗体孵育与检测
1）将膜和一抗（CCT2抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。
2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(CCT2抗体)。
3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。
4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。
5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。
6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。
7）显影曝光。
应用[4][5]
LIMK1抗体可以用于阿福豆苷通过抑制LIMK1活性发挥对前列腺癌LNCaP、PC-3细胞增殖和凋亡的影响
观察Afzelin的体外抗前列腺癌活性及其对前列腺癌相关激酶的影响。
方法(1)细胞培养：雄激素依赖性LNCaP细胞和雄激素非依赖性PC-3细胞系从美国菌种保藏中心(弗吉尼亚州,马纳萨斯)获得。并据其建议将LNCaP细胞培养于含10%胎牛血清,谷氨酰胺,2%青霉素-链霉素和0.2%庆大霉素的EMEM培养基中。PC-3细胞生长于含2 mM左旋谷酰胺、1.5 g/L碳酸氢钠(90%)+10%胎牛血清的Ham's F12K培养基中。细胞在37℃含95%空气和5%二氧化碳湿润环境中培养。
(2)细胞增殖实验：将对数生长期的LNCaP和PC-3细胞,接种于96孔培养板(5000个/孔),每孔100 u1。恒温箱培养24 h,使细胞贴壁。次日分别加入不同终浓度(0.1,1,10 ug/ml)的阿福豆苷。每组设4个平行孔。在CO2培养箱中再孵育,干预24 h,48 h,72 h后终止培养,0 ug/ml组仅加等量培养液。加入10 ul·WST-1标记溶液(WST-1细胞增殖试验试剂盒；罗氏诊断,印第安纳波利斯)后再放置培养箱中孵育2 h。根据厂家提供的说明书,用96孔板酶标比色计检测各孔420 nm处的吸光度值(17)。
(3)细胞周期分析：将培养的LNCaP和PC-3前列腺癌细胞分别加入不同的浓度的阿福豆苷孵育24 h。粘附细胞用胰蛋白酶消化并与悬浮细胞群混合,然后离心,零度PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗涤3次,将一部分被洗涤的细胞染成台盼蓝以检测细胞活性。调整细胞数至1x106细胞/ml,以2：1的比例(v/v)在冷甲醇固定过夜,碘化丙啶染色。使用Becton Dickinson(San Jose,CA)流式细胞仪检测细胞周期分布,分析各个实验条件下的细胞数不少于10,000个。使用CellQuest细胞周期分析软件进行数据分析。
(4)蛋白印迹分析：检测不同浓度(0.1,1及10μg/ml)阿福豆苷对前列腺癌LNCaP和PC-3细胞中MRCKα,LIMK1及ROCK1激酶表达的影响。采用改良Lowry分光光度法测定蛋白质浓度(DC Protein Assay;Bioroad,Hercules,CA)。分解产物在7～10%的变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。我们将分解后蛋白转输至硝化纤维,用5%脱脂牛奶或3%BSA(牛血清白蛋白)封口,以1xPBS缓冲至0.1%到20%之间。MRCKα,LIMK1抗体及ROCK1的单克隆抗体在Cell Signaling Technology(Beverly,MA)处购买,此抗体已经由制造商按照Western blotting的需求进行了适度稀释。
参考文献
[1]Kaempferol-3-O-rhamnoside isolated from the leaves of Schima wallichiiKorth.inhibits MCF-7 breast cancer cell proliferation through activation of thecaspase cascade pathway[J].Ajeng Diantini;;Anas Subarnas;;Keri Lestari;;Eli Halimah;;Yasmiwar Susilawati;;Supriyatna Supriyatna;;Euis Julaeha;;Tri Achmad;;Eka Suradji;;Chiho Yamazaki;;Kenji Kobayashi;;Hiroshi Koyama;;Rizky Abdulah.Oncology Letters,2012(5)
[2]WST-1-based cell cytotoxicity assay as a substitute for MTT-based assay for rapid detection of toxigenic Bacillus species using CHO cell line[J].Puriya Ngamwongsatit;;Padmapriya P.Banada;;Watanalai Panbangred;;Arun K.Bhunia.Journal of Microbiological Methods,2008(3)
[3]Analysis of Biochemical Control and Prognostic Factors in Patients Treated With Either Low-Dose Three-Dimensional Conformal Radiation Therapy or High-Dose Intensity-Modulated Radiotherapy for Localized Prostate Cancer[J].Sujay A.Vora;;William W.Wong;;Steven E.Schild;;Gary A.Ezzell;;Michele Y.Halyard.International Journal of Radiation Oncology,Biology,Physics,2007(4)
[4]EAU Guidelines on Prostate Cancer[J].Axel Heidenreich;;Gunnar Aus;;Michel Bolla;;Steven Joniau;;Vsevolod B.Matveev;;Hans Peter Schmid;;Filliberto Zattoni.European Urology,2007(1)
[5]朱开常.阿福豆苷通过抑制LIMK1活性发挥对前列腺癌LNCaP、PC-3细胞增殖和凋亡的影响[D].山东大学,2015.