背景[1-3]
DCX抗体是一种可以特异性结合DCX的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的DCX蛋白。DCX抗体经过多种应用验证，包括西部印迹（WB）、免疫沉淀（IP）、免疫荧光（IF）、石蜡包埋切片免疫组织化学（IHCP）、流式细胞术（FCM）和酶联免疫吸附试验（ELISA）。Doublecortin/DCX蛋白作为微管相关蛋白，在大脑皮层发育过程中神经元分散和皮层层压的早期阶段发挥着关键作用。其功能可能涉及与假定的神经元蛋白激酶DCLK1竞争与靶蛋白的结合，从而参与迁移前和迁移过程中神经元相互作用所必需的关键信号通路。这个过程可能是钙离子依赖性信号转导途径的一部分。Doublecortin/DCX还可能与PAFAH1B1/LIS-1合作，促成重叠但不同的信号通路，共同促进有效的神经元迁移。在这种复杂的细胞编排中，Doublecortin/DCX与微管蛋白和USP9X相互作用，强调其参与微管动力学的调节，并强调其在控制神经元发育的复杂分子途径中的重要性。
DCX抗体
DCX抗体使用步骤（Western Blot）：
1.样本制备
1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。
2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。
3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
2.蛋白电泳
1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。
2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。
3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。
5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。
6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。
3.转膜与封闭
1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。
2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。
3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。
4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。
5）转膜结束后，切断电源，取出膜。
6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。
7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。
8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。
9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。
10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。
11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。
4.抗体孵育与检测
1）将膜和一抗（DCX抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。
2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(DCX抗体)。
3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。
4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。
5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。
6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。
7）显影曝光。
应用[4][5]
DCX抗体可以用于尼古丁对小鼠海马神经干细胞增殖、分化的影响及机制初探
研究尼古丁是否通过nAChR-α7介导EPAC及其相关信号分子的变化,从而调节神经干细胞(neural stem cells,NSCs)发育和神经形成,为尼古丁暴露引起的神经发育毒性提供合理的解释和寻找治疗的分子靶点。
方法:1.用24小时内C57/BL6的新生小鼠,分离海马组织,培养原代小鼠海马NSCs,细胞传代至第3代第5天,进行免疫细胞化学染色,巢蛋白Nestin鉴定神经干细胞、SOX2标志物鉴定神经祖细胞、Ki-67检测NSCs增殖率;第3代NSCs诱导分化,培养5天,DCX抗体、Tuj1抗体、MAP2抗体、GFAP和S100β抗体进行免疫细胞化学染色鉴定分化能力。
2.LDH毒性检测法检测不同浓度尼古丁(1,10,100,200,300和400μM)对NSCs的毒性作用;不同尼古丁浓度处理细胞,CCK-8法测定尼古丁对NSCs活力影响;碘化丙啶染色,流式细胞仪检测不同浓度尼古丁对NSCs细胞周期的影响;不同浓度尼古丁急性处理NSCs,提取蛋白,检测p-p38MAPK、p38MAPK、pERK、ERK、pAKT、AKT、nAChR-α7、EPAC1、EPAC2、PKA、Rap1、p-CREB和CREB蛋白表达。3.第3代NSCs诱导分化,尼古丁持续处理7天,DCX抗体和GFAP抗体免疫细胞化学染色检测尼古丁10μM对NSCs分化能力的影响;提取蛋白,检测DCX和GFAP蛋白表达;分别用尼古丁、EPAC激动剂8-CPT、EPAC抑制剂ESI-09、PKA激动剂6-BNZ、PKA抑制剂H-89、ESI-09联合尼古丁以及H-89联合尼古丁条件处理细胞,DCX染色分析不同处理条件后DCX+神经元树突分支数和轴突长度;提取mRNA,qRT-PCR检测nAChR-α7、EPC1、EPAC2、PKA和Rap1 mRNA的表达。
参考文献
[1]Increased expression of CRF and CRF-receptors in dorsal striatum,hippocampus,and prefrontal cortex after the development of nicotine sensitization in rats[J].Lucia Carboni;;Benedetto Romoli;;Simon T.Bate;;Patrizia Romualdi;;Michele Zoli.Drug and Alcohol Dependence.2018
[2]Altered phosphorylation,electrophysiology,and behavior on attenuation of PDE4B action in hippocampus[J].Susan L.Campbell;;Thomas van Groen;;Inga Kadish;;Lisa High Mitchell Smoot;;Graeme B.Bolger.BMC Neuroscience,2017(1)
[3]Nicotine self‐administration remodels perineuronal nets in ventral tegmental area and orbitofrontal cortex in adult male rats[J].Dolores B.Vazquez‐Sanroman;;Reyna D.Monje;;Michael T.Bardo.Addiction Biology,2017(6)
[4]Hypothalamic regulation of regionally distinct adult neural stem cells and neurogenesis[J].Alex Paul;;Zayna Chaker;;Fiona Doetsch.Science,2017(6345)
[5]胡玉婷.尼古丁对小鼠海马神经干细胞增殖、分化的影响及机制初探[D].安徽理工大学,2019.