背景[1-3]
禽流感病毒H9亚型(AIV-H9)核酸试剂盒(荧光-PCR法)适用于各种咽拭子、鼻拭子、泄殖腔拭子、组织样品等临床样品中禽流感病毒H9和N2流感病毒的特异性检测。适用于禽流感病毒H9感染的辅助诊断、监测及流行病学调查，其检测结果仅供临床参考。
禽流感病毒H9亚型(AIV-H9)核酸试剂盒(荧光-PCR法)用一对禽流感病毒H9特异性引物，分别结合一条特异性荧光探针，用一步法双重荧光RT-PCR技术对禽流感病毒H9的RNA进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。本试剂盒中禽流感病毒H9的探针报告基团为FAM。
禽流感病毒H9亚型(AIV-H9)核酸试剂盒(荧光-PCR法)
样品的采集与RNA提取
1样品的采集
按照相关标准采集。标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-80℃，但不能超过6个月，标本运送应采用0℃冰壶。
2 RNA提取
可使用RNA提取试剂盒(过柱法-荧光配套)或其他合适的商业化产品，并按照相应试剂盒说明进行操作。
禽流感病毒H9亚型(AIV-H9)核酸试剂盒(荧光-PCR法)检测步骤：
1试剂的准备
从试剂盒中取出荧光qRT-PCR反应液(H9-qRT-PCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)。
2 qRT-PCR反应条件
将各反应管放入实时荧光PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
反转录(Reverse Transcription)1循环45℃for 10 min
预变性1循环95℃for 10 min
PCR扩增40循环95℃for 15 sec
60℃for 45 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM，淬灭基团均为None。
结果分析：
1结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
8.2试验成立判定
（1）阴性对照(NTC)：FAM通道的Ct值＞43或无Ct值。
（2）阳性对照(H3N2-PTC)：FAM通道的Ct值≤30且有明显指数增长。
以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效
3结果判定
FAM通道：Ct值≤40，H9亚型流感病毒核酸为阳性；Ct值＞43或无Ct值为阴性样本，表明H9亚型流感病毒核酸阴性。Ct值在40-43个循环之间，为灰区，需要进行重复试验。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明H9亚型流感病毒核酸阳性；否则判为样本阴性。
应用[4][5]
禽流感病毒H9亚型(AIV-H9)核酸试剂盒(荧光-PCR法)可以用于H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及免疫原性分析
本研究对H9N2亚型禽流感病毒流行毒株进行分离鉴定,通过MDCK细胞悬浮培养后进行毒力及免疫原性测定,主要研究结果如下。对疑似感染禽流感的发病鸡采集咽拭子及泄殖腔拭子,提取RNA进行禽流感病毒H9亚型(AIV-H9)核酸试剂盒(荧光-PCR法)检测。将阳性样品的咽拭子和泄殖腔拭子上清液接种到10日龄SPF鸡胚,收集的尿囊液经有限稀释法纯化3轮后,取红细胞凝集价最高的鸡胚尿囊液在鸡胚上扩大培养后进行病毒含量测定、禽流感病毒H9亚型(AIV-H9)核酸试剂盒(荧光-PCR法)鉴定、红细胞凝集价测定和特异性鉴定。实验结果显示,病毒含量测定为108.32EID50/0.1m L,透射电镜观察,该病毒为囊膜病毒,呈球形,直径约为80～120 nm。特异性鉴定结果确定为H9亚型禽流感病毒,该病毒命名为A/Chicken/Hu Nan/20/2020（H9N2）,简称Hu N20株。对纯化病毒进行纯净性检验表明Hu N20株无菌、无支原体和外源病毒污染。对禽流感病毒Hu N20株HA基因和NA基因与国内近几年分离株进行同源性比对和遗传进化分析,Hu N20株的HA基因与NA基因均属于Y280-like亚系。Hu N20株对SPF鸡的致病性实验,测定了感染鸡的排毒情况和最小感染剂量。结果表明,感染Hu N20株后1～7d均可检测到咽喉和泄殖腔排毒;对42日龄SPF鸡的最小感染剂量为105.0EID50/0.1m L。对病毒培养与灭活工艺进行了探索,采用MDCK细胞悬浮培养,细胞密度为3×10～6～4×10～6cells/m L时,0.1%的剂量接种病毒,添加胰酶浓度为60μg/m L,病毒红细胞凝集价最高可达到11 log2。
参考文献
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[4]Semi-perfusion cultures of suspension MDCK cells enable high cell concentrations and efficient influenza A virus production[J].Thomas Bissinger;;Johannes Fritsch;;Adrian Mihut;;Yixiao Wu;;Xuping Liu;;Yvonne Genzel;;Wen-Song Tan;;Udo Reichl.Vaccine.2019
[5]王新乐.H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及免疫原性分析[D].东北农业大学,2023.