淋巴细胞的主要来源是外周血，分离的原则是回收率较高，纯度较好，失活较低。分离方法根据不同的实验目的可采用梯度密度离心法，吸附分离法和黏附贴壁法等。其中利用淋巴细胞分离液进行梯度密度离心是最常用的方法。
关于淋巴细胞分离液
淋巴细胞分离液是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞分离纯化的常用试剂。可用于体外分离外周血淋巴细胞，也可用于从其他来源中分离单核细胞，包括脐带血细胞和骨髓细胞，适用于从血液和其它组织匀浆中分离所需细胞，在医学和医疗中有广泛的应用。
淋巴细胞分离液的原理
外周血中各种细胞的密度不同，例如人红细胞密度为1.093g/ml，粒细胞为1.092g/ml，淋巴细胞为1.074±0.001g/ml。淋巴细胞分离液的密度介于1.075-1.070g/ml之间，因此在离心力的作用下，不同的细胞按相应密度梯度分布，从而将不同的细胞加以分离。
淋巴细胞分离液使用注意事项
1. 分离液在低温时呈较高密度，高温时呈较低密度。因此分离液从冰箱取出后，不可立即使用，操作前应将样本和淋巴细胞分离液均恢复到室温。
2. 实验过程如果需要稀释样本，不可使用含钙、镁离子的缓冲液以及培养基，钙镁离子会导致血细胞凝集，降低细胞的得率以及纯度。
3. 抗凝剂选择：肝素、EDTA、枸橼酸。
4. 尽量避免使用高聚合材料的离心管，其带有的静电作用会导致细胞贴壁影响分离效果，推荐使用未经碱处理的玻璃离心管。
5. 吸取过多的淋巴细胞层以及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细胞数量增加。