介绍
碘酚兰，又称靛酚蓝、靛酚兰，英文名称为Indophenol Blue，化学名称可表示为N-(4-二甲基氨基苯基)-1,4-萘醌亚胺〔N-(4-Dimethylaminophenyl)-1,4-naphthoquinoneimine〕，分子式为C18H16N2O，常呈灰色、深紫色至黑色粉末或结晶。其分子中含有二甲氨基苯基和萘醌亚胺共轭结构，因而具有明显的可见光吸收。其乙醇溶液最大吸收波长约为590 nm，范围为585～595 nm。碘酚兰主要作为有机染料、分析试剂及生物染色相关试剂使用，在滴定、组织学、血液学以及含氮化合物显色分析等领域具有一定应用价值。
图一 碘酚兰
结构与显色性质
碘酚兰属于醌亚胺类染料，其分子的一端含有具有较强供电子能力的二甲氨基，而另一部分为萘醌亚胺共轭体系。较大的π共轭结构使电子跃迁所需能量降低，从而在可见光区域产生明显吸收，这也是其呈现深蓝至蓝紫色的结构基础。在乙醇中的最大吸收波长位于585～595 nm附近，摩尔吸光系数要求不低于7500。
应用
在生物组织染色中的应用
碘酚兰在生物染色方面的研究历史较早。Indophenol类染料用于脂质染色，之后仍有研究将其用于组织切片中的脂肪观察。由于其具有较强的可见颜色及对特定组织成分的染色能力，碘酚兰在早期组织化学中曾作为一种辅助染料使用。以心肌颗粒体系中的Nadi反应为对象，讨论自由基形成与蓝色靛酚类染料生成之间的关系。碘酚兰蓝色产物不仅可以作为普通染料，其形成过程还曾被用于观察组织中氧化酶相关反应及氧化还原过程。
靛酚蓝显色反应与氨的测定
在分析化学领域，碘酚兰法（indophenol blue method）的应用是氨和铵离子的比色测定。在碱性条件下，氨首先与次氯酸盐反应生成一氯胺，之后与酚类化合物发生一系列反应，最终形成具有强烈蓝色吸收的靛酚型显色产物。硝普钠通常可作为催化剂增强显色，而柠檬酸盐等缓冲体系则有助于稳定反应条件。其最终显色产物会随酚类显色剂不同而改变[1]。
试剂加入顺序会明显影响检测灵敏度和准确度。将一定pH条件下的次氯酸钠先加入含氨样品，再加入碘酚兰试剂，可以提高显色反应的灵敏度和重复性。反应体系的pH是影响显色稳定性的重要因素。通过调整显色体系提高了灵敏度和重复性，并在625 nm附近测定蓝色产物吸光度，可用于微克级氮的分析。温度同样会影响靛酚蓝显色过程。在约4.5～55 ℃范围内，温度升高能够加快蓝色产物的形成，但同时可能降低方法灵敏度。反应开始时的温度对最终吸光度影响较明显，而之后升温更多表现为缩短达到最大吸光度所需时间。因此，在进行精确定量时，温度、反应时间以及试剂加入顺序都应保持一致。
在环境水样氨氮分析中的应用
碘酚兰显色法尤其适合水体中低浓度氨氮分析。氨与相关试剂发生Berthelot型反应形成蓝色indonaphthol产物，再利用季铵盐形成离子对并富集到PTFE膜上，随后使用乙腈洗脱并在725 nm进行吸光度测定。该方法对铵离子的检出限达到2.5 μg/L，并成功应用于河水和海水样品分析。碘酚兰较大的共轭结构能够产生强烈的可见吸收，因此即使目标物浓度较低，也可以通过适当的显色、富集及分光光度检测获得较好的分析灵敏度[2]。
图二 Berthelot反应生成靛酚显色产物的反应路线
改进碘酚兰法
传统碘酚兰显色法在高浓度Na+、K+、亚硫酸根和硫化物存在时容易受到干扰，而这些物质又广泛存在于硫化物光催化体系中。通过引入高级氧化处理并建立标准化操作程序，降低了亚硫酸盐体系导致的假阳性和显色干扰，从而实现对光催化产生氨的较可靠、低成本定量。
参考文献
[1] HARWOOD J E, KüHN A L. Effect of temperature on the formation of indophenol blue in a spectrophotometric method for the determination of ammonia[J]. Water Research, 1985, 19(11): 1443-1445. DOI:10.1016/0043-1354(85)90312-4.
[2] ZHAO Y, SHI R, BIAN X, et al. Ammonia detection methods in photocatalytic and electrocatalytic experiments: How to improve the reliability of NH3 production rates?[J]. Advanced Science, 2019, 6(8): 1802109. DOI:10.1002/advs.201802109.