人内脂素/内脏脂肪素(VISFATIN)ELISA KIT

本试剂盒用于测定人血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中内脂素/内脏脂肪素(visfatin)的含量。人本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人内脂素/内脏脂肪素(visfatin)水平。用纯化的内脂素/内脏脂肪素(visfatin)捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入内脂素/内脏脂肪素(visfatin)，再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的内脂素/内脏脂肪素(visfatin)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中内脂素/内脏脂肪素(visfatin)含量。1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。 7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。1. 标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。 4. 温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。 5. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。 6. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 7. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。 8. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 9. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。内脂素(Visfatin)又称烟酰胺磷酸核苷转移酶（NAmPRT酶或NAMPT），以前被称为前B细胞集落增强因子1（PBEF1），是一种酶，由NAMPT基因编码。该蛋白的细胞内形式（iNAMPT）是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）挽救途径中的限速酶，该途径将烟酰胺转化为烟酰胺单核苷酸（NMN），负责哺乳动物中大部分NAD+的形成。当ATP存在时，iNAMPT还可以催化从焦磷酸磷酰（PRPP）合成NMN。虽然PBEF最初的细胞因子功能至今没有得到证实，但后来其他人报告或建议该蛋白具有类似细胞因子的功能。特别是Nampt/PBEF最近被重新确认为一种"新的内脏脂肪衍生激素"，名为visfatin。据报道，visfatin在人类和小鼠的内脏脂肪中都很丰富，在肥胖的发展过程中其血浆水平增加。