大鼠TOLL样受体9(TLR-9/CD289)ELISA KIT

双抗体夹心法本试剂盒用于测定大鼠血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中Toll样受体9(TLR-9/CD289)的含量。大鼠本试剂盒应用双抗体夹心法测定大鼠标本中Toll样受体9(TLR-9/CD289)水平。用纯化的Toll样受体9(TLR-9/CD289)捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入Toll样受体9(TLR-9/CD289)，再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的Toll样受体9(TLR-9/CD289)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中Toll样受体9(TLR-9/CD289)含量。1、组织标本 对于样本要求保持鲜重，称取样本中的重量不小于50mg，一般以1g为基准,但不严格要求固定样本每个重量必须达到相同的水平。匀浆的比例选取10%，相当于1g组织加9ml的匀浆液来进行匀浆。匀浆液选取PBS（PH=7.2-7.4，浓度为0.01mol/L）。匀浆过程选用组织匀浆器，冰浴上匀浆。(或者进行液氮碾磨)，离心取上清，离心转速选用5000转每分，时间是15分钟。取上清液待检。 2-1、贴壁细胞用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5分钟后收集细胞；悬浮细 胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS 洗涤3次。每 1×106 个细胞中加入150-200μL PBS重悬并通过反 复冻融使细胞破碎(若含量很低可减少PBS的体积)。将提取液于1500×g离心10分钟，取上清检测。 2-2超声波破碎条件：用20kHz频率，150W的功率，在冰浴中进行超声波破碎，每破碎2s，间隔3s，反复破碎三次。 2-3反复冻融：收集细胞悬液，4℃低温离心（3000rpm，5min），弃上清，加入一定量PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-20℃ 冷冻30 min，37℃解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。 3、标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融. 4、不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。1. 标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。 4. 温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。 5. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。 6. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 7. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。 8. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 9. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值），测定应在加终止液后15分钟以内进行。可检测样本中大鼠的TLR9，且与其类似物无明显交叉反应。Toll样受体9是由基因TLR9编码的蛋白质，也被称为CD289，是Toll样受体（TLR）家族的成员。它是免疫系统细胞（包括树突细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和其他抗原呈递细胞）中表达的重要受体。它优先结合于细菌和病毒中存在的DNA，并触发信号级联反应，导致促炎细胞因子反应。癌症、感染和组织损伤都可以调节它的表达和激活。它也是自身免疫性疾病的重要因素，并且对有助于调节自身免疫炎症的合成TLR9激动剂和拮抗剂进行了积极的研究。