己糖激酶

己糖激酶(Hexokinase)是生物体呼吸代谢过程中的关键酶之一，具有催化己糖磷酸化的作用。己糖激酶存在于所有细胞中，是细胞产生能量所需要的一种酶，共有 5 种亚型，其中 I 和 II 分布在线粒体外膜，与电压依赖性阳离子通道蛋白结合;这种部位让己糖激酶能直接获得线粒体产生的 ATP，ATP是己糖激酶的底物之一。

己糖激酶在固有免疫系统中发挥模式识别受体功能，类似免疫系统的守门人角色，具有重要的功能。这种机制不仅在动物细胞存在，在人体细胞内同样存在。因此，己糖激酶常被用作监测人体健康状况的指标，目前己糖激酶已应用于血糖检测试剂盒中。本试剂盒用于测定鱼血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中己糖激酶(HK)的含量。本试剂盒应用双抗体夹心法测定鱼标本中己糖激酶(HK)水平。用纯化的己糖激酶(HK)捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入己糖激酶(HK)，再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的己糖激酶(HK)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中己糖激酶(HK)含量。1、组织标本 对于样本要求保持鲜重，称取样本中的重量不小于50mg，一般以1g为基准,但不严格要求固定样本每个重量必须达到相同的水平。匀浆的比例选取10%，相当于1g组织加9ml的匀浆液来进行匀浆。匀浆液选取PBS（PH=7.2-7.4，浓度为0.01mol/L）。匀浆过程选用组织匀浆器，冰浴上匀浆。(或者进行液氮碾磨)，离心取上清，离心转速选用5000转每分，时间是15分钟。取上清液待检。 2-1、贴壁细胞用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5分钟后收集细胞；悬浮细 胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS 洗涤3次。每 1×106 个细胞中加入150-200μL PBS重悬并通过反 复冻融使细胞破碎(若含量很低可减少PBS的体积)。将提取液于1500×g离心10分钟，取上清检测。 2-2超声波破碎条件：用20kHz频率，150W的功率，在冰浴中进行超声波破碎，每破碎2s，间隔3s，反复破碎三次。 2-3反复冻融：收集细胞悬液，4℃低温离心（3000rpm，5min），弃上清，加入一定量PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-20℃ 冷冻30 min，37℃解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。 3、标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融. 4、不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。1. 标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。 4. 温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。 5. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。 6. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 7. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。 8. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 9. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值），测定应在加终止液后15分钟以内进行。已糖激酶为细针状结晶。商品有冷冻干燥粉、70%饱和硫酸铵结晶悬浮液和50%甘油溶液。12个月无降低活性现象，县浮液应防止冻结。常用诊断用酶。生物研究。检定生物液体中葡萄糖水准和ATP水准及肌酸激酶的偶联反应。用于生化研究，临床上常用作诊断酶，用于葡萄糖的分析，制备尿糖和血糖试纸，制药工业中用做维生素C及B₁₂制剂的稳定剂也可用于蛋白质的脱糖、罐头酒类的储藏。以酵母为原料，磷酸钠抽提后用硫酸铵分级，再经透析、DEAE-Sephadex柱层析、DEAE-纤维素柱层析、P-I和P-II羟基磷灰石柱层析、硫酸铵重结晶得产品。