大鼠 转化生长因子Β(TGF-Β)ELISA试剂盒

双抗体夹心法本试剂盒应采用双抗体夹心法测定血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中的含量。猪1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融. 7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。1. 标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；。 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。 4. 温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。 5. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。 6. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 7. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟. 8. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 9. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人转化生长因子β(TGF-β) 水平。用纯化的转化生长因子β(TGF-β) 捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入转化生长因子β(TGF-β) ，再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的转化生长因子β(TGF-β) 呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中转化生长因子β(TGF-β) 含量。可检测样本中大鼠的TGF-β，且与其类似物无明显交叉反应。转化生长因子β（TGF-β）是一种多功能的细胞因子，属于转化生长因子超家族，TGFB蛋白由所有白血球系产生。被激活的TGF-β与其他因子复合形成丝氨酸/苏氨酸激酶复合物，与TGF-β受体结合。TGF-β受体由1型和2型受体亚单位组成。TGF-β结合后，2型受体激酶磷酸化并激活1型受体激酶，从而激活一个信号级联。这导致不同的下游底物和调节蛋白的激活，诱导不同靶基因的转录，在分化、趋化、增殖和许多免疫细胞的激活中发挥作用。TGF-β由包括巨噬细胞在内的许多细胞类型分泌，呈潜伏状态，与另外两种多肽--潜伏的TGF-β结合蛋白（LTBP）和潜伏的相关肽（LAP）复合。血清蛋白酶如浆蛋白酶催化活性TGF-β从复合物中释放。这通常发生在巨噬细胞的表面，潜伏的TGF-β复合物通过其配体血栓软骨素-1（TSP-1）与CD36结合。激活巨噬细胞的炎症刺激物通过促进血浆蛋白的激活而增强活性TGF-β的释放。巨噬细胞还可以内吞由浆细胞分泌的IgG结合的潜伏TGF-β复合物，然后将活性TGF-β释放到细胞外液中。其主要功能之一是调节炎症过程，特别是在肠道。TGF-β还在干细胞分化以及T细胞调节和分化中发挥关键作用。由于其在免疫和干细胞调节和分化中的作用，它是癌症、自身免疫性疾病和传染病领域中研究较多的一种细胞因子。TGF-β超家族包括内源性生长抑制蛋白；TGF-β表达的增加往往与许多癌症的恶性程度和细胞对TGF-β的生长抑制反应的缺陷相关。其免疫抑制功能的失调也与自身免疫性疾病的发病机制有关，尽管其作用是由存在的其他细胞因子的环境介导的。