前面，我们已经探讨了单阳对照如何构建稳定的补偿矩阵，以及同型对照如何界定非特异性结合的背景边界。然而，在多色流式实验中，随着荧光通道数量的增加，另一种背景信号逐渐显现——补偿泄漏（Compensation Spillover）。此时，仅靠单阳与同型对照已不足以完全揭示数据的全貌，FMO对照（Fluorescence Minus One Control）应运而生，成为高维流式实验中不可或缺的“第三只眼”。
一、FMO对照的技术逻辑：从补偿泄漏到背景噪声的精准控制
在多色流式实验中，尤其是超过四色的检测中，背景信号的来源往往不仅仅是非特异性结合，更多的是来自荧光素之间的光谱重叠，未能完全被补偿矩阵校正的部分，这种现象被称为补偿泄漏。
即便补偿矩阵计算得当，在实际样本中，由于荧光强度的动态范围、仪器状态和染料降解等因素，残留的泄漏信号仍然可能干扰弱表达抗原的准确识别。FMO对照正是为了捕捉这种“补偿后残留”的信号而设计的参照系统。
图1. FMO对照排除荧光干扰（图片来源于网络）
二、FMO对照的核心价值：补偿泄漏与背景噪声的精确分离
FMO对照并非替代同型或单阳对照，而是对它们的补充与深化，进一步提高实验精度。FMO对照的核心价值在于：
1. 识别补偿泄漏的真实影响
FMO对照能够模拟真实样本环境中目标通道所受的光谱泄漏影响，帮助研究者判断某一信号是否为真实阳性，还是仅仅由于补偿泄漏的叠加。
2. 精准设定弱表达抗原的设门边界
对于低表达指标（如细胞因子、趋化因子受体、激活标志等），FMO是最可靠的阴性边界参照，远优于同型对照。
3. 验证补偿矩阵的稳定性
若FMO中目标通道出现明显阳性偏移，提示补偿设置可能不足或过度，实验者需要回溯并调整补偿参数。
图2. 使用空白设门与用FMO对照设门对比（DOI: 10.1038/nri1416）
FMO对照能够有效优化补偿矩阵和信号判定，但它还不能完全涵盖所有背景干扰，尤其是非特异性结合和系统噪声等方面。在实际操作中，我们常会将同型对照与FMO对照结合使用，即：FMO对照中需要减去的抗体用对应的同型对照抗体来替代，这样可以提供更加完整的背景信号分析，确保实验结果的精确性。
三、同型+FMO对照：双重保障优化实验结果
同型对照作为背景信号的参考，能够揭示实验中的噪声和非特异性结合，但它并不能作为“阴性群体”的标准使用。而FMO对照通过剔除一个标记来评估每个标记的贡献，帮助我们准确界定阳性与阴性群体，特别是在标记溢出和弱阳性群体分析时。同型+FMO对照可以结合二者的优势，在确定实验噪声和非特异性结合的同时还可以辅助界定阴阳分群。
同型+FMO对照的优势
1. 全面的背景信号分析
同型对照能够揭示系统中的非特异性结合或噪声，而FMO对照则能帮助我们优化标记的贡献，两者结合使用，确保每个标记的信号准确无误。
2. 精确划定阴阳细胞群
在多色流式实验中，FMO对照帮助我们优化补偿和标记间的独立性，而同型对照提供的背景信号则帮助我们进一步确认“阴性”的准确位置，尤其是在面对弱阳性细胞群时。
3. 提高实验的可重复性与稳定性
同型和FMO对照的结合，确保实验在不同平台、实验者之间的一致性，减少背景噪声和干扰，使实验结果更具稳定性和可靠性。
四、如何设置同型+FMO对照
我们还是以四色检测人类外周血单个核细胞（PBMC）中的Treg细胞亚群为例（抗体为：CD3-PerCP、CD4-FITC、CD25-APC和Foxp3-PE）。同型+FMO对照需要按照下表来设置：
表1. 同型+FMO对照设置参考表
注意事项：
1. 对照组细胞需与全染管相同，实验处理：固定、破膜、洗涤、Fc阻断等所有步骤都相同，同时也须与全染管完全同步、使用同一批试剂。
2. 因Foxp3需要固定破膜，同型+FMO对照也需要进行相同操作。
3. 不是所有指标都需要设置同型+FMO对照，优先选择信号弱、分群不清的关键指标（如细胞因子、磷酸化蛋白、低表达抗原），本方案中CD25和Foxp3是关键指标，CD3、CD4属于分群清晰的强阳性指标，可以不做。
结语：从“有对照”到“会用对照”
流式细胞术的对照设计，关键不在于“越多越好”，而在于“越准越好”。单阳对照为补偿提供基础，同型对照描绘背景的轮廓，而FMO对照则进一步剥离补偿泄漏的干扰。通过合理设计和结合使用这些对照，能够构建起一个更为精确、可靠的多色流式数据框架。
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