酶联免疫吸附测定（ELISA）的技术原理、方法分类与操作流程

一、定义与原理

 
   酶联免疫吸附测定是一种利用酶标记抗原或抗体，对液体样本（如血液、细胞液）中待测抗体或抗原进行检测的方法。该技术将可溶性抗原或抗体固着于聚苯乙烯等固相载体表面，通过抗原-抗体特异性结合反应，实现对免疫反应产物的定性与定量分析。

二、主要应用

 
   该技术广泛应用于样品中抗体、蛋白质、细胞因子、激素等成分的定性与定量检测，具体包括以下几个方面：

  ① 体液中各类蛋白质的检测，涵盖含量极微的蛋白质组分。
  ② 激素的检测，如分子量较小的甾体激素等。
  ③ 抗生素及药物成分的检测。
  ④ 病原体抗原的检测，例如利用胶体金技术检测禽流感病毒抗原。
  ⑤ 应用纯化抗原检测样本中的相应抗体。

三、常用ELISA实验方法分类

   在实际应用中，基于基础检测原理衍生出多种酶联免疫吸附测定（ELISA）方法。根据反应模式的不同，常见的类型包括夹心法、直接法、间接法和竞争法。 

（一）夹心法

   双抗体夹心法主要适用于检测具有两个或以上抗原表位的大分子物质，不适用于小分子抗原。该方法首先将特异性抗体（捕获抗体）包被于固相载体表面，经洗涤去除未结合的抗体及杂质后，加入待检样品，样品中的特异性抗原与固相抗体结合，形成固相抗原-抗体复合物；再次洗涤去除未结合物质后，加入酶标抗体（检测抗体），使其与复合物中的抗原结合，经彻底洗涤去除未结合的酶标抗体，最后加入底物显色，显色强度与待测抗原含量呈正相关。

   双抗体夹心法亦可用于抗体的检测，其反应模式与检测抗原相似，即采用特异性抗原包被固相载体并制备酶标抗原结合物，以检测样本中相应的抗体。

（二）直接法

   直接法主要用于抗原的检测。将待测抗原包被于固相载体表面，经洗涤去除未结合的抗原及杂质后，加入酶标特异性抗体，使抗体与固相抗原结合，彻底洗涤去除未结合的酶标抗体，加入底物显色。固相载体上携带的酶量与样本中待测抗原的含量相关。

（三）间接法

   间接法首先将抗原包被于固相载体表面，形成固相抗原，经洗涤去除未结合的抗原及杂质后，加入待检样本中的特异性一抗，使其与固相抗原结合，形成固相抗原-抗体复合物；洗涤后加入酶标二抗，该二抗与复合物中的一抗结合，从而间接标记上酶；经再次洗涤去除未结合的酶标二抗，加入底物显色。显色强度与样本中特异性抗体的含量相关。

（四）竞争法

   竞争法常用于检测小分子物质，如半抗原、激素及药物等。该方法中，待检样本中的游离抗原与固相载体上固定的抗原共同竞争结合有限量的特异性抗体。样本中游离抗原含量越高，与抗体结合的比例越大，导致固相抗原结合的抗体量相应减少。经洗涤去除样本中抗原-抗体复合物后，仅保留固相抗原结合的抗体系列，加入酶标二抗及底物显色，显色强度与待测抗原含量呈负相关。

四、ELISA免疫测定基本步骤

   ELISA免疫测定的操作流程主要包括以下六个步骤：

   1. 包被

   将特异性抗体或抗原以适当浓度包被于固相载体表面，经孵育后使固相载体结合相应生物大分子。

   2. 加样

   将经适当稀释的待检样品以每孔0.1 ml加入已包被的反应孔中，同时设置空白对照孔、阴性对照孔及阳性对照孔。置37℃孵育1小时，使待测物质与固相载体上的抗原或抗体充分结合，随后进行洗涤，去除未结合的物质。

   3. 加酶标抗体

   于各反应孔中加入经滴定后确定最佳稀释度的新鲜稀释酶标抗体，每孔0.1 ml。置37℃孵育0.5～1小时，使酶标抗体与固相免疫复合物特异性结合，随后彻底洗涤，去除未结合的酶标抗体。

   4. 加底物显色

   于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液，每孔0.1 ml，置37℃避光孵育10～30分钟，使酶催化底物显色。

   5. 终止反应

   于各反应孔中加入2 M硫酸溶液，每孔0.05 ml，以终止酶催化反应，稳定显色结果。

   6. 结果判定

   可采用肉眼观察法：在白色背景上直接观察反应孔内颜色变化，颜色越深表示阳性程度越强，阴性反应呈无色或极浅色。亦可采用仪器测定法：使用ELISA检测仪在450 nm波长处，以空白对照孔调零后，读取各反应孔的吸光度（OD）值，用于定量或半定量分析。

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