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小鼠骨髓样本中的中性粒细胞的分选获得

发布日期:2026/8/19 15:52:41发布人：上海优宁维生物科技股份有限公司阅读量：8

一、实验整体流程

二、骨髓样本制备

1. 在 6 孔板中每孔加入 3 mL 骨髓收集缓冲液，置于冰上备用。

2. 处死小鼠后，取股骨和胫骨，用无菌工具剥离骨表面所有皮肤、肌肉和肌腱。

3. 将清洁完成的骨头放入含收集缓冲液的 6 孔板孔中，全程保持冰上操作。

4. 所有骨头收集并清洁后，剪去骨骺，将骨头剪口朝下放入 0.5/1.5 mL 离心管组合中。

5. 离心法冲出骨髓：室温（20–25°C）条件下 10,000×g 离心 30 秒。

6. 弃去骨头，将收集到的细胞沉淀用 1 mL 重悬缓冲液轻柔重悬，避免产生气泡，随后转移至 15 mL 锥形管。

7. 红细胞裂解：针对 1 mL 细胞悬液，加入 10 mL 红细胞裂解缓冲液，轻轻颠倒混匀，室温孵育 2 分钟。切勿涡旋。

8. 4°C 条件下 300×g 离心 10 分钟。

9. 准备 70 μm 细胞筛，用 2 mL 重悬缓冲液润洗。

10. 吸弃上清，用 5 mL 重悬缓冲液重悬细胞沉淀。

11. 将 5 mL 细胞悬液通过 70 μm 滤网过滤，再用 5 mL 重悬缓冲液冲洗滤网。

12. 4°C 条件下 300×g 离心 10 分钟。

13. 弃上清，用 1 mL 重悬缓冲液重悬细胞沉淀。

14. 细胞计数与活力检测：取 15 μL 细胞悬液与 15 μL 台盼蓝混合，取 15 μL 混合液上样至 Countess 计数玻片，用自动细胞计数仪完成计数；若无自动计数仪，可改用血球计数板。

三、磁珠孵育染色与润柱

1. 用 100μL MagSep Separation Buffer 重悬 1×10^7 个细胞

注意：试剂用量可根据样品体积等比例调整；需留存分选前样本，用于检测中性粒细胞初始比例。

2. 向样品中加入 10 μL Mouse Neutrophil Biotin Antibody Cocktail，轻轻混匀

注意：本步骤混匀可采用移液器轻轻吹打 2-3 下。

3. 使抗体与细胞充分结合，2-8℃条件下孵育 10 min。

4. 充分混匀 Streptavidin Beads，向样品中加入 15 μL Streptavidin Beads。

5. 轻柔混匀磁珠与细胞，2-8℃条件下孵育 15 min。

6. 加入 10 倍细胞体积的 MagSep Separation Buffer 洗涤细胞，400g 离心 7min 后弃去上清，重悬至原体积。

四、上样与洗脱

1. 将细胞悬液上样至分选柱，收集流出液，即未标记的阴性细胞组分。

2. 用缓冲液洗涤柱子 3 次，每次 500μL；待柱内液体完全流空后，再加入下一次洗涤液。

3. 合并所有流出液作为阴性组分；将分选柱移出磁场，置于收集管上方。

4. 向柱内加入 1mL 缓冲液，用配套柱塞快速、用力推压，洗脱磁性标记的阳性细胞。

注意：如需更高纯度，可换用新柱重复分选 1 次。

五、流式鉴定

通过流式细胞术分别对分选前样本、分选后阳性成分、分选后阴性成分进行检测，鉴定中性粒细胞的比例与纯度，验证分选富集效果。

分选前

分选后阳性成分

分选后阴性成分

六、相关产品推荐

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产品分类产品编号产品名称规格

分选磁珠

S0K1015

Mouse Neutrophil Isolation Kit (Column‑Based)

1ml/2ml

分选架

S0D3005

MultiStand

1pc

分选器

S0D3001

Starter MagSep Separator (L)

1pc

分选柱

S0D3011

L Separation Columns

25 Columns

分选缓冲液

S0D3018

Starter MagSep Separation Buffer

250ml

细胞筛网

abs7231

40μm 细胞筛网（300 目，蓝色，底面过滤）

50 个 / 箱

红细胞裂解

abs9101

RBC Lysis Buffer（红细胞裂解液 1×）

100ml

封闭试剂

S0B0599

Mouse FcR Blocking Reagent（阻断 FcR 非特异性染色）

200T

染色缓冲液

abs9475

Flow cytometry staining buffer

500ml

流式鉴定

S0B1666

PerCP‑Cy5.5 Rat Anti‑Mouse CD45 Antibody (30‑F11)

50T