一、产品概述

本试剂盒专为体外鉴定和表征小 G 蛋白（Cdc42、Rac1 和 RhoA）的鸟嘌呤核苷酸交换因子（Guanine nucleotide Exchange Factor, GEF）而设计，Rho GTPases GEF 筛选试剂盒由Cytoskeleton推出，艾美捷代理。试剂盒采用荧光检测方法，基于纯化蛋白进行反应，不适用于细胞裂解液。该工具可支持 GEF 活性生化表征、新型 GEF 蛋白的筛选以及 GEF 抑制剂的高通量筛选。

二、核心应用场景

鉴定 Cdc42、Rac1 或 RhoA 的 GEF 蛋白：使用纯化蛋白进行体外测定，快速判断目标蛋白是否对特定 Rho GTPase 具有交换活性。

GEF 活性的生化表征：定量分析 GEF 的催化效率、底物特异性及动力学参数。

高通量筛选 GEF 抑制剂：采用 384 孔板格式，适用于大规模化合物文库筛选，寻找靶向特定 GEF-Rho 相互作用的小分子调节剂。

三、试剂盒内容（每盒支持 20–130 次测定，视 GTPase 种类而定）

组分 | 说明

Exchange buffer | 交换缓冲液，提供反应所需离子环境

Cdc42-His 蛋白 | 重组 His 标签 Cdc42 蛋白

RhoA-His 蛋白 | 重组 His 标签 RhoA 蛋白

Rac1-His 蛋白 | 重组 His 标签 Rac1 蛋白

hDbs-His 蛋白 | 重组 His 标签人 Dbs 蛋白（已知 GEF，用作阳性对照）

384 孔板 | 高通量筛选用微孔板

96 孔板 | 常规检测用微孔板

四、所需设备与材料

温控荧光读数仪：激发波长 485 nm ± 20 nm，发射波长 535 nm ± 20 nm。

移液器、多道移液器或自动液体处理工作站（推荐用于高通量筛选）。

纯化待测 GEF 蛋白（用户自备）或化合物文库（用于抑制剂筛选）。

五、检测原理

本试剂盒基于荧光标记的鸟嘌呤核苷酸类似物在自由状态与结合状态下的光谱差异。当荧光核苷酸类似物与 Rho GTPase 结合时，荧光强度显著增强。在待测 GEF 存在下，GTPase 加速交换结合的 GDP 为荧光核苷酸类似物，导致荧光信号随时间升高。通过监测荧光强度的变化速率，即可定量评估 GEF 活性。

检测参数：

激发波长：485 nm

发射波长：535 nm

检测时长：约 2 小时

六、生物活性测定方法（标准流程）

以下为使用已知 GEF（如 hDbs）验证试剂盒性能的典型步骤。用户可根据自身待测 GEF 进行调整。

1. 试剂准备

将 Exchange buffer 平衡至室温。

解冻各 GTPase 蛋白（Cdc42、Rac1、RhoA）和阳性对照 hDbs 蛋白，置于冰上。

准备荧光核苷酸类似物（试剂盒未提供，需另行购买或按实验室常规配方配制）。

2. 反应体系配制（96 孔板格式）

每孔终体积通常为 50–100 μl，包含：

1× Exchange buffer

50–100 nM 目标 GTPase

0.5–2 μM 荧光核苷酸类似物

待测 GEF 蛋白（浓度范围：1–500 nM，根据预实验确定）

阳性对照孔：加入 hDbs 蛋白（终浓度约 10–50 nM）

阴性对照孔：不加 GEF 或用 Exchange buffer 替代

3. 荧光监测

将反应板置于温控荧光读数仪中，设定激发 485 nm，发射 535 nm。

温度控制：22°C 或 30°C（根据 GEF 活性最适温度调整）。

每 30–60 秒读取一次荧光值，持续 1–2 小时。

4. 数据分析

计算每个时间点的荧光强度变化（ΔF = Fₜ – F₀）。

对时间作图，曲线斜率为初始交换速率。

将待测 GEF 孔的速率与阴性对照孔比较，计算相对活性。

阳性对照（hDbs）应显示出显著高于背景的荧光增强。

七、关键特性总结

特性 | 描述

检测方法 | 荧光法（Ex 485 nm / Em 535 nm）

检测靶点 | Cdc42、Rac1、RhoA

阳性对照 | hDbs（人 Dbs 蛋白，His 标签）

适用样本 | 纯化蛋白（不适用于细胞裂解液）

检测通量 | 96 孔或 384 孔板格式

检测时长 | 约 2 小时

主要用途 | GEF 鉴定、生化表征、抑制剂高通量筛选

八、注意事项与优化建议

1. 不适用细胞裂解液：裂解液中含有核苷酸、盐分及其他干扰物质，会严重影响荧光核苷酸类似物的结合特异性，导致假阳性或假阴性结果。必须使用纯化的待测 GEF 蛋白。

2. GTPase 预加载：部分实验方案建议先将 GTPase 与未标记 GDP 孵育，以确保其处于 GDP 结合状态，提高交换效率。本试剂盒的 Exchange buffer 已优化，但用户可根据经验进行调整。

3. 蛋白浓度优化：不同 GEF 的催化效率差异可达 1000 倍以上，建议对待测 GEF 进行浓度梯度预实验（例如 1、10、100、500 nM）。

4. 阳性对照验证：首次使用试剂盒时，务必运行 hDbs 阳性对照孔，以确认试剂盒组分活性。hDbs 对 RhoA 和 Cdc42 均有交换活性，对 Rac1 活性较弱，可作为底物特异性参照。

5. 高通量筛选格式：使用 384 孔板时，反应体积可缩小至 20–30 μl。推荐使用自动液体工作站以确保加样精度。筛选抑制剂时，先加入化合物与 GEF 预孵育 10–15 分钟，再加入 GTPase 和荧光核苷酸类似物启动反应。

6. 数据标准化：将待测孔荧光速率与阳性对照孔（设为 100%）和阴性对照孔（设为 0%）进行比较，计算相对活性百分比。

警告：本产品仅限研究使用，不适用于人类或兽医治疗。