Nucleolin（核仁素）是一种主要的核仁磷酸蛋白，参与前体 rRNA 转录、核糖体合成与成熟，并能结合组蛋白 H1 诱导染色质凝缩，同时在转录延伸中发挥作用。由艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔抗核仁素（NCL）抗体亲和纯化抗体（货号：A300-711A） 经抗原亲和纯化，特异性识别 人 Nucleolin 蛋白 C 端区域（第 550–710 位氨基酸），适用于免疫组织化学（IHC）、免疫组织化学-免疫荧光（IHC‑IF）、免疫沉淀（IP）和免疫印迹（WB），并交叉识别人和小鼠 Nucleolin。本文基于详细产品规格，从基本特性、免疫原设计、各应用优化流程、功能背景及常见问题排查等方面提供系统性技术参考。
一、产品基本规格与储存信息
参数| 内容
靶标| Nucleolin（NCL，C23）
反应性| 小鼠、人类
应用| IHC、IHC‑IF、IP、WB
宿主/克隆性 | 兔 / 多克隆
形式| 完整 IgG
免疫原| 第660位残基至C末端之间（具体表位第550–710位）
亚型| IgG
标记物| 未标记
纯度| 抗原亲和纯化
抗原种属| 人类
浓度| 200 µg/ml
保存条件| 2 – 8 °C
有效期| 自收货之日起 1 年
缓冲液| Tris-缓冲盐水，含 0.1% BSA 及 0.09% 叠氮化钠
储存与操作提示：
抗体须始终保存于 2–8 °C，严禁冷冻，冷冻会导致蛋白聚集和效价下降。
缓冲液含 0.1% BSA 作为稳定蛋白，有助于稀释后抗体的短期稳定性；叠氮化钠为防腐剂，可能抑制 HRP 活性，若用于活细胞成像需去除。
抗体浓度为 200 µg/ml，使用时应按推荐稀释比例计算用量。
浓度采用比尔定律标定（A280 = 1.4 对应 1 mg/mL IgG）。
二、推荐应用与实验条件
免疫印迹（Western Blot, WB）
推荐稀释范围：1:2,000 – 1:10,000
封闭液与抗体稀释液：5% 脱脂牛奶 / TBST
一抗孵育：4 °C 过夜
二抗推荐：Goat anti‑Rabbit IgG (H+L) HRP（A120-101P）
检测方式：增强型化学发光（ECL）
WB 优化流程
1. 样本制备：
阳性对照：HeLa、HEK293、NIH/3T3 或小鼠组织裂解液（Nucleolin 在增殖细胞中高表达）。
裂解液：RIPA 或 SDS 上样缓冲液。
上样量：20–30 μg 总蛋白（Nucleolin 丰度较高，过度上样可能导致多条带）。
2. 电泳：使用 8–10% SDS‑PAGE（Nucleolin 分子量约 100–110 kDa，因其磷酸化形式可能迁移至 110 kDa 以上）。
3. 转印：PVDF 膜，250 mA 恒流 90 分钟。
4. 封闭：5% 脱脂牛奶 / TBST，室温 1 小时。
5. 一抗孵育：用 5% 牛奶 / TBST 按 1:2,000–1:10,000 稀释（首次建议 1:5,000）。
6. 洗涤：TBST 洗涤 3 × 10 分钟。
7. 二抗孵育：HRP‑山羊抗兔（1:10,000–1:20,000），室温 1 小时。
8. ECL 检测。
> 预期结果：应在约 100–110 kDa 处检测到一条主带，有时可见较弱的降解片段（约 70 kDa 或 50 kDa）。若出现多条高背景带，可提高稀释度至 1:10,000。
免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）
用量：6 μg 抗体 / mg 总蛋白裂解液
裂解液要求：非变性裂解缓冲液（50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP‑40，不含 SDS，添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂）。
IP 详细步骤
1. 细胞裂解：收集 1–2 个 10 cm 皿细胞（约 5–10 × 10⁶），加入 500 μL IP 裂解液，冰上裂解 30 分钟，离心取上清。
2. 蛋白定量：BCA 法。
3. 预清除（可选）：加入 20 μL Protein A 磁珠，4 °C 旋转 1 小时。
4. 抗体结合：取 1 mg 总蛋白，加入 6 μg A300-711A 抗体，4 °C 旋转孵育过夜。
5. 捕获复合物：加入 30 μL Protein A 磁珠，继续孵育 2 小时。
6. 洗涤：用 IP 裂解液洗涤 4–5 次。
7. 洗脱：加入 30 μL 2× SDS 上样缓冲液（含 DTT），95 °C 加热 10 分钟。
8. WB 检测：取上清进行 SDS‑PAGE，使用 抗兔 IgG 轻链特异性 HRP 二抗 并在封闭液中添加 5% 正常猪血清（S100‑020），以避免重链干扰。
注意：Nucleolin 分子量约 100 kDa，远高于抗体重链（≈55 kDa），常规二抗也可使用；但 IP‑WB 检测低丰度互作蛋白时，仍推荐轻链特异性二抗以获得最干净背景。
免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）
推荐稀释范围：1:100 – 1:2,000（宽范围，可根据组织类型优化）
抗原修复：柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0），高压或微波热修复 10–15 分钟。
样本类型：福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的人或小鼠组织切片。
封闭：5% 正常血清 / PBS 或 3% BSA / PBS，室温 30 分钟。
检测：HRP/DAB 显色（IHC）或荧光二抗（IHC‑IF）。
IHC 实验要点
Nucleolin 定位于细胞核仁（明亮点状）及核质，IHC 染色应为核仁/核特异性。
建议使用扁桃体、乳腺癌组织或增殖活跃的组织作为阳性对照。
稀释度从 1:500 开始，若信号过强或背景高，提高至 1:2000。
免疫组织化学-免疫荧光（IHC‑IF）
推荐稀释范围：1:50 – 1:1,000
同一修复条件：柠檬酸 pH 6.0 热修复。
二抗：使用荧光标记的抗兔二抗（如 Alexa Fluor 488、568），避免使用与自发荧光重叠的波长。
封片：含 DAPI 的抗淬灭封片剂，共聚焦或荧光显微镜观察。
IF 提示：核仁染色应呈现典型的 3–5 个明亮点状区域（对应核仁）。降低抗体浓度（如 1:1000）可减少核质弥散背景。
三、该抗体的核心优势
四重应用验证：WB、IP、IHC、IHC‑IF 全覆盖，满足蛋白表达、互作与组织定位需求。
C 端特异性表位：避免与 N 端或 RRM 域蛋白交叉，WB 单条带清晰。
人/小鼠交叉反应：适用于转基因小鼠模型及人类临床样本。
宽稀释范围：WB 1:2,000–1:10,000，IHC 1:100–1:2,000，IHC‑IF 1:50–1:1,000，充分适应不同实验灵敏度。
亲和纯化低背景：IHC 和 IF 背景低，核仁信号突出。
含 BSA 稳定剂：2–8 °C 液态保存一年，稀释后短期稳定。