β-葡萄糖苷酸酶 (β-glucuronidase,β-GUS ) 试剂盒说明书
(货号：ZK-0579W 微板法96样)
一 、产品简介：
β-葡萄糖苷酸酶(β-GUS,EC 3.2.1.31)是一种分布广泛的水解酶。在动物和微生物中都 有分布；但在绝大多数植物细胞和许多细菌及真菌内不存在内源GUS 活性，因而GUS 基因 广泛用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因。
β-葡萄糖苷酸酶(β-GUS) 水解对硝基酚-D-葡萄糖醛酸苷生成对硝基酚 (PNP), 通过检 测该产物在405nm 处的增加速率即可得出β-GUS 酶活性大小。
二、试剂盒的组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体100mL×1瓶 | 4℃保存 |
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试剂一 | 液体35mL×1瓶 | 4℃保存 |
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试剂二 | 粉剂mg×1支 | -20℃保存 | 临用前甩几下或离心使粉剂落入底部， 再加4.2mL蒸馏水溶解备用，-20℃保存 |
试剂三 | 液体40mL×1瓶 | 4℃保存 |
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标准品 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂 |
三、所需的仪器和用品：
酶标仪、96孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰。
四、β-葡萄糖苷酸酶(β-GUS) 活性测定：
1、样本制备：
①组织样本：取约0.1g 组织，加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆。15000rpm,4℃ 离 心10min, 取上清，置冰上待测。
【注】:若增加样本量，可按照组织质量 (g): 提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取
②细菌或细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细 胞，加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率20%或200W, 超声3s, 间隔10s, 重复30次);15000 rpm 4℃离心10min, 取上清，置冰上待测。
【注】:若增加样本量，可按照细菌或细胞数量 (10⁴个):提取液体积 (mL) 为500~1000:1的比例 进行提取。
2、 上机检测：
①酶标仪预热30min 以上，调节波长至405nm。
②所有试剂解冻至室温，在EP管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 20 | 20 |
试剂一 | 140 | 180 |
试剂二 | 40 |
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迅速混匀，37℃保温30min |
试剂三 | 200 | 200 |
混匀，若有沉淀需室温12000rpm离心5min后，取 200μL上清液至96孔板中，于405nm处测定吸光值A, △A=A测定-A对照(每个测定管需设一个对照管)。 |
【注】1.若△A较小，可以增加37℃保温反应时间T(如增至1小时),或增加样本量V1(如增至40μL, 则试剂一相应减少),则改变后的T 和V1需重新代入计算公式计算。
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2.△A 最好控制在标准曲线的线性范围内，若△A 的值超过1,可对样本进行稀释再测定，稀释
倍 数D 代入计算公式计算；或减少样本量V1 (如减至10μL, 则试剂一相应增加),或减少
37℃保温反应时间T (如减至10min), 则改变后的T 和 V1 需重新代入计算公式计算。
五 、结果计算：
1、标准曲线：y=26.969x-0.0037,x 是标准品(PNP) 摩尔质量(μmol);y 是△A。
1.2
y=26.969x-0.0037 R²=0.9994
0.8 0.6 0.4
0.2
0.01 0.02 0.03 0.04
标准品(μmol)
0.05
2、按照样本质量计算：
酶活定义：在37℃下，每克组织每小时水解lμmoL 底物产生PNP 定义为1个酶活单位。
β-GUS 活性(μmoL/h/g 鲜重)=[(△A+0.0037)÷26.969]÷(W×V1÷V)÷T×D
=3.71×(△A+0.0037)÷W×D
3、按照样本蛋白浓度计算：
酶活定义：在37℃下，每毫克蛋白每小时水解 lμmoL 底物产生PNP 定义为1个酶活单位。 β-GUS(μmoL/h/mg prot)=[(△A+0.0037)÷26.969]÷(CprxV1)÷T×D
=3.71×(△A+0.0037)÷Cpr×D
4、按细胞数量计算：
酶活定义：在37℃下，每10⁴个细胞每小时水解1μmoL 底物产生PNP 定义为1酶活单位。 β-GUS(μmoL/h/10⁴cell)=[(△A+0.0037)÷26.969]÷(500×V1)÷T×D=0.0074×(△A+0.0037)×D
5、 按 液 体 体 积 计 算 ：
酶活定义：在37℃下，每毫升液体每小时水解 lμmoL 底物产生PNP 定义为1个酶活单位。 β-GUS(μmoL/h/mL)=[(△A+0.0037)÷26.969]÷V¹÷T×D=3.71×(△A+0.0037)
W--- 样品质量，g; V-- 提取液体积，1mL;
V1---- 上清液体积 (mL),0.02mL; T-- 反应时间，30 min=1/2h;
D--- 稀释倍数，未稀释即为1;
Cpr--- 上清液蛋白质浓度， mg/mL; 建议使用本公司的BCA 蛋白质含量测定试剂盒。
附 ：标准曲线制作过程：
1 制备标准品母液(10μmoL/mL): 向标准品EP 管里面加入1mL 蒸馏水溶解，若有结晶析出，需 37℃水浴至完全溶解。
2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0,0.4,0.8,1.2,1.6,2μmoL/mL。也可根据实际样本来调整标 准品浓度。
3 依据20μL 的标准品+180 μL 的试剂一，再加200μL 的试剂三，于405nm 处读值；根据结果即可制 作标准曲线。
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