多糖含量试剂盒说明书

(货号：ZK0593W  微板法 96样）

一、产品简介：

糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长488 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖含量的测定

二、试剂盒组分与配制：

三、所需的仪器和用品：

酶标仪、96孔板、水浴锅/金属浴、可调式移液器、乙醇、浓硫酸（不允许快递）、研钵。

四、多糖含量的测定：

建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

建议：选取样本做几个梯度的稀释，选取适合本次实验的稀释倍数D。

1 多糖待检液制备：

a.组织样本：

① 样本烘干研磨过40目筛，称取3mg过筛后细末至2mLEP管中，加入2mL蒸馏水，于沸水浴（95-100℃）加热2小时（若放在金属浴上面可用重物压盖防止EP管崩开；间隔20min带防护手套轻轻晃动混匀几下），加热结束后取出放置至室温，8000rpm离心5min，

② 取0.2mL上步离心后的上清液至新EP管中，再加入1mL乙醇混匀，于4℃放置1小时，取出后8000rpm离心5min后弃上清，留沉淀；

③ 上步所得沉淀中再加入1mL80%乙醇混匀几下（自备：取80mL乙醇溶于20mL蒸馏水中），8000rpm离心5min后弃上清，留沉淀（可采用使EP管轻轻倒置于吸水纸上约5min吸干剩余上清液，尽量避免沉淀损失）；

④ 向上步所得沉淀中加入2mL蒸馏水，于沸水浴（95-100℃）加热直到沉淀全部溶解（约5min）即多糖待检液。

b.液体样本：

① 取0.2mL液体(可先做两个样本预测定，确定适合本批液体样本取样量V2)，至新

EP管中，再加入1mL乙醇混匀（使乙醇在整个液体中占比至少80%），于4℃放置1小时，取出后8000rpm离心5min后弃上清，留沉淀；

②上步所得沉淀中再加入1mL80%乙醇混匀几下（自备：取80mL乙醇溶于20mL蒸馏水中），8000rpm离心5min后弃上清，留沉淀（可采用使EP管轻轻倒置于吸水纸上约5min吸干剩余上清液，尽量避免沉淀损失）；

③ 向上步所得沉淀中加入2mL蒸馏水，于沸水浴（95-100℃）加热直到沉淀全部溶解（约5min）即多糖待检液。

2、上机检测：

① 酶标仪预热30min以上，调节波长至488nm，调节水浴锅或金属浴至95-100℃。

② 向标准品中加入1mL蒸馏水即1mg/mL葡萄糖母液，用蒸馏水稀释20倍（1份母液:19份水）成0.05mg/mL葡萄糖，用于测定。在EP管中依次加入：

【注】:1. 如果ΔA大于1，需要将样本用蒸馏水稀释，计算公式中乘以相应稀释倍数D。

2. 若ΔA值在零附近即低于0.005，则可增加样本取样质量W，则改变后的W和

V1需代入公式重新计算。

五、结果计算：

1、标准方程为y=86.454x + 0.0065；x为标准品质量（mg），y为吸光值ΔA。

2、按样本重量计算：

多糖(mg /g重量)=[(ΔA-0.0065)÷86.454]÷(W×V1÷V)×10×D

=2.313×(ΔA-0.0065)÷W×D

3、按质量分数（%）计算：

多糖(%重量)=[(ΔA-0.0065)÷86.454]÷(W×V1÷V)×10×D×10^-3×100%

=[0.2313×(ΔA-0.0065)÷W×D]%

4、按液体体积计算：

多糖(mg /mL 液体)=[(ΔA-0.0065)÷86.454]÷(V2×V1÷V)×D

=0.2313×(ΔA-0.0065)÷V2×D

V---样品提取液总体积，2mL；    V1---测定时待检液体积，0.1mL；

V2---液体取样体积，mL；        10---②歩中取0.2mL处理后变成2mL体积；         

W---样本质量，g；               D---自行稀释倍数，未稀释即为1。

附：标准曲线制作过程：

1 制备标准品母液（1mg/mL）：从标准品管中称量取出2mg至一新EP管中，再加2mL蒸馏水混匀溶解即1mg/mL的葡萄糖（母液需在两天内用且-20℃保存）。

2 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1. mg/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。

3 依据测定管的加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。