乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl CoA carboxylase，ACC)试剂盒说明书
（货号：ZK-0913F 分光法 24样）
一、产品简介：
乙酰辅酶A羧化酶（ACC，EC 6.4.1.2）广泛存在于生物界。在生物体内催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A，是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。ACC的活性在一定程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。
ACC催化乙酰辅酶A、NaHCO3和ATP生成丙二酰辅酶A、ADP和无机磷，通过钼酸铵定磷法测定无机磷的增加量来测定ACC酶活性大小。
二、试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 提取液30mL×1瓶 | 4℃保存 |
|
试剂一 | 液体20mL ×1瓶 | 4℃保存 |
|
试剂二 | 粉体mg×1支 | -20℃保存 | 用前甩几下使试剂落入底部，再加0.55mL蒸馏水，混匀溶解备用。 |
试剂三 | 液体4mL×1瓶 | 4℃保存 |
|
试剂四 | A:粉体mg×1瓶 B:液体3mL×1瓶 | 4℃保存 | 临用前加2.9mL的B液，再加37.1mL的蒸馏水，混匀溶解备用。 |
标准品 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂 |
【注】：全程操作需无磷环境；试剂配置用新枪头和玻璃移液器等，也可用一次性塑料器皿，避免磷污染。
三、所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL玻璃比色皿（光径1cm）、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
四、乙酰辅酶A羧化酶（ACC）活性测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：称取约0.1g组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心15min，取上清，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例提取
② 细胞样本：
先收集细胞到离心管内，离心后弃上清；取500万细胞加入1mL提取液；超声波破碎细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；4ºC约12,000rpm离心10min，取上清作为待测样品。
【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为500~1000：1的比例进行提取。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热30min以上，设置温度37℃，调节波长至700nm，蒸馏水调零。
② 试剂放在37℃水浴5min；
③ 在EP管中依次加入：
试剂名称（μL） | 测定管 | 对照管 |
试剂一 | 280 | 300 |
样本 | 150 | 150 |
试剂二 | 20 |
|
37℃ 孵育30min |
试剂三 | 60 | 60 |
混匀，12000rpm，4℃离心5min，上清液待测 |
④ 显色反应，在EP管中依次加入：
上清液 | 150 | 150 |
试剂四 | 600 | 600 |
混匀，室温静置3min，全部澄清液体转移至1mL玻璃比色皿中，700nm下读取各管吸光值，△A=A测定-A对照（每个样本做一个自身对照）。 |
【注】若△A差值小于0.01，可增加样本取样质量W（如增至0.2g），或增加③步中样本加样体积V1(如由150μL增至300μL，则试剂一相应减少),或延长③步中37℃条件下孵育时间T（如由30min延至60min），则改变后的W和V1和T需代入计算公式重新计算。
五、结果计算：
1、标准曲线方程：y = 0.8474x - 0.0164，x是标准品摩尔质量（μmol/mL），y是△A。
2、按蛋白浓度计算：
定义：每小时每毫克组织蛋白分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/mg prot)= [(△A+0.0164)÷0.8474×V2]÷(V1×Cpr)÷T=8.03×(△A+0.0164)÷Cpr
3、按样本鲜重计算：
定义：每小时每克组织分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/g 鲜重)=[(△A+0.0164)÷0.8474×V2]÷(W×V1÷V)÷T
=8.03×(△A+0.0164)÷W
4、按细菌或细胞密度计算：
定义：每小时每1万个细菌或细胞分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/104 cell)=[(△A+0.0164)÷0.8474×V2] ÷(500×V1÷V)÷T=0.016×(△A+0.0164)
V---加入提取液体积，1mL； V1---加入样本体积，0.15mL； V2---酶促反应总体积，0.51mL；
T---反应时间，1/2小时； W---样本鲜重，g； 500---细菌或细胞总数，500万；
Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的BCA蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1 制备标准品母液（50μmol/mL）：标准品用1mL试剂一溶解。（母液需在两天内用）。
2 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3 依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。