Rhod-4, AM,Cell Permeant 钙离子荧光探针的使用方法

产品描述

Rhod-2是红色荧光Ca2+荧光探针，但Rhod-2的线粒体定位和细胞中高基底Ca2+信号使其在某些细胞应用中受限制。另外，Rhod-2在488nm处的激发波长使其在某些只有488nm激发光源的仪器比如FLIPRTM上信号很弱。Rhod - 4, AM，Cell Permeant正是根据这些缺陷而改良的，具有以下特征：

1） Rhod - 4, AM，Cell Permeant的激发和发射波长是530nm和555nm。虽Rhod - 4, AM，Cell Permeant激发波长是530nm，但在488nm处激发下的信号也较强。除了能在514nm，532nm和546nm的长波长激发之外，Rhod - 4, AM，Cell Permeant用氩离子激发器在488nm激发下也能得到荧光信号。Rhod - 4, AM，Cell Permeant随着增加的Ca2+浓度荧光信号而增强（555nm发射波长），一旦与Ca2+结合荧光约增强＞200倍。由于许多细胞受刺激后的Ca2+浓度提高5~10倍，因此，Rhod - 4, AM，Cell Permeant是一款检测范围内Ca2+浓度变化的灵敏探针。

2） 受激动剂刺激后，Rhod - 4, AM，Cell Permeant在细胞内的荧光会强于Rhod-2（信噪比）。而且，Rhod - 4, AM，Cell Permeant定位在细胞胞浆内，不像Rhod-2定位在线粒体。另外，Rhod - 4, AM，Cell Permeant具低温依赖性的细胞加载性，不管室温还是37℃产生相似的结果。这一特征使Rhod - 4, AM，Cell Permeant在HTS中应用较广。

Rhod - 4, AM，Cell Permeant,是Rhod-2的一种乙酰甲酯衍生物，具有细胞膜渗透性，简单培养后即可轻易进入细胞。进入细胞内，便被其内酯酶剪切生成不具膜渗透性的Rhod - 4, AM，Cell Permeant，从而滞留在胞内以发挥相应生理功能。

信息参数

（1）其他名称：Rhod-4, Acetoxymethyl Ester

（2）分子量：1015.96

（3）状态：红色固体

（4）Ex/Em：530/555 nm

（5）Kd（Ca2+结合）：525NM

（6）溶解性：溶于DMSO（2~5mM）

（7）纯度：≥95%

（8）储存条件：-20℃避光干燥

使用方法

【注意】以下使用方法用作参考，可根据具体的实验条件做出调整。

 试剂准备

（1）配制Pluronic F-127母液：称取100mg Pluronic F-127粉末中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30min。溶液室温保存，不用冷藏。如有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。

（2）HHBS Buffer(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.3) 或者其他生理缓冲液。

 操作步骤

（1）用无水DMSO溶解Rhod - 4, AM，Cell Permeant配制成2-5mM的储存液，或将已配好的Rhod - 4, AM，Cell Permeant储存液取出于室温回温。。准备Rhod - 4, AM，Cell Permeant工作液之前，有时需要往Rhod - 4, AM，Cell Permeant储存液中加入适量的20% Pluronic F-127溶液，以增强AM探针的水溶性。

【注①】：Rhod - 4, AM，Cell Permeant染色工作液制备前，添加等体积20% Pluronic F-127溶液到Rhod - 4, AM，Cell Permeant+DMSO储存液，从而使Pluronic F-127的工作浓度约为0.02%。

【注②】：Pluronic F-127可以防止AM探针在溶液中聚合并促使探针进入细胞。但Pluronic F-127可降低AM探针的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议加入储存液保存。

（2）用HHBS或其他生理缓冲液将 Rhod - 4, AM，Cell Permeant+DMSO储存液稀释到1-10µM的工作液。

【注①】：Rhod - 4, AM，Cell Permeant,应用在大部分细胞的加载浓度为4-5µM，具体的使用浓度需根据实验要求进行调整。为了避免过度加载，建议在取得有效结果的基础上尽量使用低探针浓度。

【注②】：Rhod - 4, AM，Cell Permeant工作液需现配现用，避免反复冻存。

（3）【可选】如果细胞内含有机阴离子转运体，丙磺舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone，0.1-0.25mM）可能需要加入细胞培养基内，以降低去酯化探针的泄露水平。

【注①】：丙磺舒或磺吡酮储存液相当偏碱，因此加入培养基后需要重新调整pH。

（4）将准备好的Rhod - 4, AM，Cell Permeant工作液加入细胞，加入量以覆盖细胞为准。室温或37℃孵育30min-1h。

【注①】：若使用含血清的培养基，血清内酯酶会降解AM，从而降低Rhod - 4, AM，Cell Permeant加载效果。而含酚红培养基会使本底值略偏高，建议加入染色工作液前，对细胞清洗2~3次。

【注②】：关于孵育的时间，如果做实验不能确定，建议先孵育30min，看荧光效果；如果细胞死亡较多，适当缩短时间；如果荧光强度太弱，适当延长时间。

【注③】：降低探针加载温度可能会降低探针的区室化现象。

（5） 吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理缓冲液（如有必要，使用含转运体抑制剂如2.5mM丙磺舒的缓冲液）清洗细胞1~2次，以去除残留探针。

（6）室温再孵育30min以保证细胞内AM的去酯化。

（7）用适当的仪器如激光共聚焦、流式细胞仪、荧光酶标仪，以及波长Ex/Em=530/555 nm来进行检测。

注意事项

（1） 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

（2）乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。

（3）Rhod - 4, AM，Cell Permeant在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可在20-25℃温育片刻至全部融解后使用。

（4）Rhod - 4, AM，Cell Permeant使用时，建议储存液现配现用，分装成单次用量，严格做到≤-20℃密封干燥冻存，以防止受潮。为了保证良好的实验效果，尽量在短时间内使用。

（5）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。