武汉尚睿生物CRISPR/Cas12a基因编辑酶，18086049136
产品简介
尚睿生物科技有限公司自主研发的专利酶CRISPR/SrCas12a-7（Cas12a） 属于2类V型RNA引导的核酸内切酶，为一种特定来源的微生物基因组中编码的基因(Sr代表尚睿生物缩写)。CRISPR/SrCas12a-7蛋白由向导RNA（crRNA）引导剪切带有特异性序列的单链或双链DNA(ssDNA或dsDNA)。CRISPR/SrCas12a-7 会在PAM 为5' -TTN-3'或者5' -TTTN-3' 的目标DNA 3' 末端约17 个碱基处切割，并留下 5' 末端悬垂末端。CRISPR/SrCas12a-7蛋白在目标 DNA 结合后，CRISPR/SrCas12a-7 max会切割顺式的目标 DNA 和反式的非目标单链 DNA (ssDNA) ，该核酸内切酶在25至42℃范围内具有核酸切割活性。CRISPR/SrCas12a-7在细胞内具有较高的基因组切割活性，混合为SrCas12a-7 /crRNA（核糖核蛋白复合物）后转染细菌或细胞，可快速实现靶基因的高效编辑。
产品名称：SrCas12a-7（Cas12a）
表达系统：E.coli 大肠杆菌
蛋白分子量：150.88kDa
反应温度：25°C至 42°C 温度范围内具有核酸切割活性
使用范围/产品用途：适用于动植物、水产、微生物细胞内基因编辑
产品特点或优势
（1）在 25°C 至42°C 温度范围内具有核酸切割活性，相对Cas9具有更宽的温度范围，更适合水产生物的基因编辑，
（2）相对Cas9分子质量小，crRNA更短，细胞传递效率更高，
（3）CRISPR/SrCas12a-7 会在PAM 为5' -TTN-3'或者5' -TTTN-3' 的目标DNA 3' 末端约17 个碱基处切割，并留下 5' 末端悬垂末端，与Cas9产生平末端相比，可作为Cas9系统的极大补充，甚至在某些编辑领域中比Cas9系统更具优势，
（4）CRISPR/SrCas12a-7 与crRNA形成的核糖核蛋白（RNP）直接转移到细胞中的方法具有更安全、更快、脱靶效应更低、编辑效率更高等优点。
质量保证（产品标准）
编号 | 检测项目 | 检测方法 | 质量标准 | 检测结果 | 结果判定 |
① | 外观 | 目测 | 应为无色澄明液体 | 无色澄明液体 | 符合标准 |
② | 酸碱度 | pH计 | 6.4±0.5 | 6.4 | 符合标准 |
③ | 蛋白浓度(mg/ml) | 紫外分光光度计 | 1-10mg/ml | 3.6 mg/ml | 符合标准 |
④ | 纯度(SDS-PAGE) | SDS-PAGE | ≥90.00% | 95% | 符合标准 |
⑤ | 体外活性（体外顺切割）(1pmol ) | 酶切靶标+琼脂糖凝胶电泳 | ≥90.00% | ≥99%靶标被切开 | 符合标准 |
⑥ | 内毒素 | 凝胶法 | <1EU/μg | <0.1 EU/μg | 符合标准 |
⑦ | 无菌检查 | 平板涂布法 | 应无菌生长 | 无菌 | 符合标准 |
⑧ | DNase残留 | DNA孵育+凝胶电泳 | 观察电泳后DNA条带的弥散度 | DNA条带无弥散 | 符合标准 |
⑨ | RNase 残留 | RNA孵育+凝胶电泳 | 观察电泳后RNA条带的弥散度 | RNA条带无弥散 | 符合标准 |
⑩ | 核酸内切酶污染 | 带多克隆酶切位点的质粒孵育+凝胶电泳 | 质粒切割电泳扣除背景后≤20%即为合格，反之不合格。 | ＜2% | 符合标准 |
⑪ | 支原体检查 | PCR | 阴性 | 阴性 | 符合标准 |
12 | 细胞内活性 | 斑马鱼受精卵显微注射+PCR扩增测序 | ≥80.00% | 100% | 符合标准 |
应用案例
1.顺式切割反应体系
组分 | 体积 | 终浓度 |
SrCas12a-7(0.4mg/ml) | 1-2μL | 0.02-0.04μg |
10 × rcutsmart Buffer | 2μL | 1× |
crRNA(10μM) | 0.5μL | 250nM |
Target DNA(1μM) | 0.5μL | 25nM |
Nuclease-free Water | Up to 20 μL | / |
推荐反应条件：37℃反应30-60min，85℃灭活5min。
2.注射斑马鱼卵体系
1000个卵体系 | 10ul体积 |
Rcutsmart 10× | 1ul |
Cas12a-7（200-300ng/ul终浓度） | 1ul |
Cas12a-sgRNA（200ng/ul终浓度） | 1ul |
ddH2O | 7ul |
3.酶的切割活性（顺式切割）胶图
真实应用案例
1. 斑马鱼基因组的提取
（1）根据水生动物（鱼类）基因组提取试剂盒说明书进行提取斑马鱼基因组
（2）或使用碱裂解法提取斑马鱼基因组
2. tyr/slc24a5目的基因的扩增
（1）根据基因库斑马鱼tyr/slc24a5基因序列设计上下游引物对目的片段进行PCR扩增。
（2）基因片段与预测条带大小一致
3. 敲除目的基因的sgRNA的制备
（1）可通过网站http://www.rgenome.net/cas-designer/进行Cas12a-7 PAM的sgRNA设计,选择分值最高的sgRNA进行体外活性测定
（2）Cas12a crRNA 转录合成
（3）体外Cas12a-sgRNA活性测定
活性测定体系 | 20ul体积 |
Rcutsmart10× | 2ul |
srCas12a-7max（1.2mg/ml） | 1ul |
Cas12a-sgRNA（900ng/ul） | 1ul |
DNA模板(70ng/ul) | 3ul |
ddH2O | 13ul |
27℃反应1小时，后加蛋白酶K ，65℃消化15min，设计无sgRNA为对照，电泳检测酶切效果，选择活性高的sgRNA注射鱼卵。
体外目的tyr基因片段Cas12a-sgRNA切割活性的测定结果图
体外目的slc24a5基因片段Cas12a-sgRNA切割活性的测定结果图
4) 注射斑马鱼卵体系
1000个卵体系（10ul总体积） | 终浓度 |
SrCas12a-7 | 300ng/ul |
Cas12a-sgRNA | 200ng/ul |
ddH2O | 补至10ul |
5) 注射后斑马鱼体色的观察结果
敲除tyr/ slc24a5基因的斑马鱼为绿色
正常对照组的斑马鱼
6) 注射后斑马鱼敲除基因测序结果
公司合成的SrCas12a-7蛋白显微注射（蛋白终浓度209ng/uL）斑马鱼胚胎，共检测16尾，有效检测9尾，突变9尾，群体突变率100%。
关键字： 生物酶;基因编辑酶;Cas12a;CRISPR;
武汉尚睿生物科技有限公司是一家专业从事 CRISPR/Cas 新一代核酸检测技术及其产品研发、生产、推广应用的科技型企业。公司建设有设备齐全的净化实验室和生产车间,拥有自主 CRISPR/Cas 核酸检测技术。公司与华中农业大学等高校专家合作，技术力量雄厚。
公司主营业务是以自主知识产权 CRISPR/Cas 核酸检测技术为核心，研发了猪病、禽病等经济动物和宠物系列病原体检测、转基因检测试剂盒、配套检测箱、结果自动判读数据处理贮存的手机 APP 产品生产销售和兽医远程诊断服务。公司目前已打造了基于CRISPR系统介导的体外诊断综合服务平台， 包括（1）核酸酶蛋白原料制备平台；（2）CRISPR诊断试剂盒研发与生产平台；（3）标准物质研发与生产平台；（4）现场病原体核酸即时检测平台。
尚睿生物以自身科技实力和专业能力引领 CRISPR/Cas 核酸检测技术新潮流，尊重法律，科学管理，品质优先，合作共赢，让核酸检测变得更简单，共创生物分子学检测的辉煌。
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