技术原理
本试剂盒采用TaqMan探针法实时荧光定量PCR技术。其原理基于Taq DNA聚合酶的5'→3'核酸外切酶活性，通过特异性探针与靶序列结合后，在扩增过程中被切割，使5'端荧光报告基团与3'端淬灭基团分离，产生荧光信号。通过实时监测荧光信号变化，实现对石韦核酸的定性和定量检测。
产品名称 | 石韦探针法PCR鉴定试剂盒 | 英文名称 | Folium Pyrrosiae Probe-based PCR Identification Kit |
产品规格 | 50T | 产品分类 | 荧光定量PCR |
检测类型 | PCR检测 | 产品货号 | PR4974 |
产品特点
高灵敏度：优化的引物和探针设计确保低拷贝数样本的检测
高特异性：针对石韦高度保守区设计，避免与其他微生物的交叉反应
即用型设计：预混反应体系，减少操作步骤
质量控制：提供阳性质控品，便于区分假阴性结果
兼容性：适用于主流荧光定量PCR仪
试剂组成
| 组分 | 规格 | 数量 |
| 探针法qRT-PCR缓冲液 | 500μL | 1管 |
| 探针法qRT-PCR酶混合液 | 100μL | 1管 |
| 荧光PCR专用模板稀释液 | 1mL | 1管 |
| 石韦探针法qRT-PCR引物混合液 | 100μL | 1管 |
| 石韦qRT-PCR探针 | 50μL | 1管 |
| 石韦阳性对照(1×10⁸拷贝/μL) | 50μL | 1管 |
| 说明书 | - | 1份 |
储存与运输
运输条件：低温运输（-20℃）
储存条件：-20℃避光保存
稳定性：避免反复冻融（建议不超过7次）
实验前准备
自备试剂与耗材：
无核酸酶离心管（0.2mL、1.5mL）
滤芯吸头（10μL、200μL、1000μL）
RNA提取试剂盒（如使用RNA样本）
无核酸酶水
仪器设备：
荧光定量PCR仪
离心机
涡旋混合器
微量移液器
操作步骤
标准曲线制备（定量检测）
标记6支离心管（2-7号），各加入45μL模板稀释液
在7号管中加入5μL阳性对照（1×10⁸拷贝/μL），混匀得1×10⁷拷贝/μL标准品
依次进行10倍系列稀释至2号管（1×10²拷贝/μL）
样本处理
使用适当方法提取样本RNA/DNA
建议设置阳性对照（PC）和阴性对照（NC）
PCR反应体系（20μL）
| 组分 | 体积 |
| 探针法qRT-PCR缓冲液 | 10μL |
| 探针法qRT-PCR酶混合液 | 2μL |
| 石韦qRT-PCR探针 | 1μL |
| 石韦探针法引物混合液 | 2μL |
| 模板DNA/RNA | 5μL |
PCR反应程序
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 逆转录 | 50℃ | 30min | 1 |
| 预变性 | 94℃ | 10min | 1 |
| 变性 | 94℃ | 15sec | 40 |
| 退火/延伸 | 60℃ | 1min | 40 |
注：荧光信号在60℃退火/延伸步骤采集（FAM通道）
结果分析
定量分析
以标准品浓度的log值为横轴，Ct值为纵轴绘制标准曲线
根据样本Ct值计算初始模板量
定性分析
阳性：Ct值≤35且有典型扩增曲线
阴性：Ct值≥40
可疑：35<Ct值<40，需重复检测
注意事项
实验分区操作，避免污染
不同批号试剂不可混用
阳性对照最后加入，避免污染其他反应管
本产品仅限科研使用
操作人员需具备分子生物学实验基础
质量控制
阴性对照：Ct值应≥40或无扩增曲线
阳性对照：应有典型扩增曲线，Ct值≤30
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