产品基本信息
规格：50次/盒（20μL反应体系）
适用样本：DNA模板（需用户自备）
保存条件：-20℃避光保存，有效期12个月。
用途：科研用途，适用于地龙（Pheretima）的定性或荧光定量PCR检测。
产品名称 | 地龙探针法PCR鉴定试剂盒 | 英文名称 | Pheretima Probe-based PCR Identification Kit |
产品规格 | 50T | 产品分类 | 荧光定量PCR |
检测类型 | PCR检测 | 产品货号 | PR5139 |
试剂盒组成
| 成分 | 规格 | 功能 |
| 探针法qPCR缓冲液 | 500μL | 提供反应体系基础环境 |
| 探针法qPCR酶混合液 | 50μL | 含Taq酶、逆转录酶等 |
| 荧光PCR专用模板稀释液 | 1mL | 标准品稀释及阴性对照 |
| PCR引物-探针干粉 | 50T | 特异性扩增地龙DNA靶序列 |
| PCR阳性对照（10^7拷贝/μL） | 50μL | 标准曲线制备及质控 |
操作步骤
1. 标准曲线制备（定量检测需执行）
用阳性对照按10倍梯度稀释（10^1–10^6拷贝/μL），独立操作避免污染。
标记离心管（6–1号），依次加入稀释液和阳性对照，涡旋混匀后冰上保存。
2. 样本DNA提取
建议设置阴性对照（NC）和阳性对照（PC），提取方法需兼容常规DNA试剂盒。
3. qPCR反应体系（20μL）
| 组分 | 样品管 | 阴性对照管 | 标准曲线管 |
| qPCR缓冲液 | 10μL | 10μL | 10μL |
| 酶混合液 | 2μL | 2μL | 2μL |
| 探针 | 1μL | 1μL | 1μL |
| 引物混合液 | 2μL | 2μL | 2μL |
| 样本DNA/标准品 | 5μL | - | 5μL |
| 超纯水 | - | 5μL | - |
4. 扩增程序
逆转录：50℃ 30分钟（若含RNA步骤）；
预变性：94℃ 10分钟；
40循环：94℃ 15秒 → 60℃ 1分钟（采集FAM通道信号）。
结果分析
定量检测：以标准曲线log值为横轴、Ct值为纵轴，计算样本浓度。
定性检测：
阳性：Ct≤36，且有典型扩增曲线；
阴性：Ct≥40或无扩增；
可疑（36<Ct<40）：需复测确认。
注意事项
防污染：分区分操作（样本处理、试剂配制、扩增），使用带滤芯枪头。
质控要求：
阴性对照：Ct≥40；
阳性对照：Ct≤35且扩增曲线正常。
局限性：
样本质量、提取效率、运输条件可能影响结果；
基因变异可能导致假阴性。
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