该试剂盒基于 TaqMan 荧光探针法（Real-time RT-PCR）。
双重靶标设计： 为了确保检测的准确性，试剂盒通常采用双重荧光 PCR技术。
FAM 通道（H7 基因）： 针对 H7 亚型流感病毒的血凝素（HA）基因保守序列。
HEX/VIC 通道（N9 基因）： 针对 N9 亚型流感病毒的神经氨酸酶（NA）基因保守序列。
ROX 通道（内参）： 部分试剂盒包含内源性内参（如 RNase P），用于监控样本采集质量及排除 PCR 抑制物干扰。
检测机制： 试剂盒利用逆转录酶将病毒 RNA 转化为 cDNA，再通过 Taq 酶进行扩增。随着扩增循环进行，荧光探针被切断，释放荧光信号。只有当样本中同时检测到 H7 和 N9 的特异性荧光信号时，才能确诊为 H7N9 亚型禽流感病毒感染。
2. 检测目标与应用
目标病原： H7N9 亚型禽流感病毒（AIV-H7N9）。
应用领域：
临床辅助诊断： 用于疑似人感染 H7N9 禽流感患者的早期确诊。
动物疫病监测： 用于家禽（鸡、鸭、鹅等）及活禽交易市场的疫情排查。
环境监测： 用于养殖场、屠宰场环境样本（如污水、粪便）的检测。
样本类型： 鼻咽拭子、咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、泄殖腔拭子、组织匀浆液等。
3. 试剂盒组成（典型配置）
根据市场主流品牌的配置，试剂盒通常包含以下组分：
组分名称 规格/含量 作用
PCR 反应液 (Mix) 500 μL - 1 mL x 1管 含 dNTPs、缓冲液、Mg2、引物/探针混合液
酶混合液 (Enzyme Mix) 50 μL - 100 μL x 1管 含逆转录酶、热启动 Taq 酶
阳性对照 (Positive Control) 50 μL x 1管 含 H7N9 靶基因的质粒或灭活病毒
阴性对照 (Negative Control) 50 μL x 1管 无菌双蒸水
说明书 1 份 操作指南和参数说明
注：部分试剂盒可能将引物探针与反应液分开分装，使用前需按比例混合。
4. 操作流程简述
样本处理： 采集拭子或组织样本，使用病毒 DNA/RNA 提取试剂盒提取病毒 RNA。
试剂配制（冰上操作）： 按照说明书比例（如 N+2 法，N 为样本数）混合反应液和酶，分装到 PCR 管中。
加样： 向分装好的反应管中分别加入 5-10 μL 的模板 RNA（样本、阴性对照、阳性对照）。
上机扩增： 将 PCR 管放入荧光定量 PCR 仪中。
5. 反应程序与结果判读
推荐反应程序：
逆转录： 50℃，15-30 分钟。
预变性： 95℃，5-10 分钟。
PCR 循环： 95℃ 15 sec → 60℃ 30-45 sec（收集荧光），40-45 个循环。
结果判读标准：
阳性（+）：
FAM 通道和 HEX 通道均出现典型的 S 型扩增曲线。
且 Ct 值 ≤ 35（或说明书设定的阈值）。
结论：样本中检出 H7N9 亚型禽流感病毒核酸。
阴性（-）：
FAM 和 HEX 通道均无 Ct 值，或 Ct 值 > 35。
结论：样本中未检出 H7N9 亚型禽流感病毒核酸。
单重阳性（疑似）：
仅 H7 或仅 N9 单通道阳性，提示可能存在其他亚型流感病毒（如 H7N2 或 H5N9）感染，需进一步测序鉴定。
实验有效性：
阳性对照： FAM 和 HEX 通道均需有明显扩增（Ct 值在预期范围内）。
阴性对照： 无扩增曲线。
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