肉毒梭状芽孢杆菌A型外毒素基因染料法荧光定量PCR试剂盒 新品

预期用途

本试剂盒用于定性检测食品、环境样本或临床标本中 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）A型 的神经毒素基因（BoNT/A），采用 SYBR Green I 染料法 进行实时荧光定量PCR（qPCR）检测。适用于食品安全监测、临床诊断及科研分析。

检测原理

靶标基因：肉毒梭菌A型外毒素基因（BoNT/A）保守区域。

方法：

使用特异性引物扩增BoNT/A基因片段。

SYBR Green I 染料嵌入双链DNA中，在PCR过程中释放荧光信号，实时监测扩增曲线。

内参系统：含有人工添加的内参照（Internal Control, IC），用于监控PCR抑制物及反应有效性。

试剂盒组分

| 组分 | 规格（48 Tests） | 储存条件 |

| qPCR Master Mix（含SYBR Green I） | 1.2 mL | -20℃避光 |

| BoNT/A 引物混合液（干粉/预混） | 48 µL × 2 | -20℃ |

| 阳性对照（BoNT/A DNA） | 50 µL | -20℃ |

| 阴性对照（无核酸水） | 1 mL | -20℃ |

| 内参照（IC） | 50 µL | -20℃ |

| RNase-Free Water | 1.5 mL | 室温 |

样本要求

样本类型：食品匀浆液、土壤提取液、粪便、伤口分泌物等。

预处理：

需先提取样本DNA（推荐使用柱式基因组DNA提取试剂盒）。

DNA浓度建议 ≥ 10 ng/µL，OD260/280 = 1.8~2.0。

储存：提取后DNA于-20℃保存，避免反复冻融。

检测流程

1. 反应体系配制（20 µL/反应）

| 组分 | 体积 |

| qPCR Master Mix | 10 µL |

| BoNT/A 引物混合液 | 2 µL |

| 内参照（IC） | 1 µL |

| 模板DNA | 2 µL |

| RNase-Free Water | 补足至20 µL |

注意：每批反应需设 阳性对照（2 µL 阳性DNA）、阴性对照（2 µL 水）。

2. qPCR程序设置

| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | 信号采集 |

| 预变性 | 95℃ | 3 min | 1 | - |

| 扩增 | 95℃ | 15 sec | 40 | SYBR通道 |

| 退火/延伸 | 60℃ | 30 sec | | 每循环结束时采集 |

| 熔解曲线分析 | 60℃ → 95℃ | +0.5℃/sec | 1 | 连续采集 |

结果判读

阈值设定：自动或手动调整至指数扩增期。

阳性判定：

Ct ≤ 35 且熔解曲线Tm值符合预期（参考Tm：85±1℃）。

内参照Ct值正常（表明无抑制剂干扰）。

阴性判定：

无扩增曲线（Ct = Undetermined）且内参照正常。

无效结果：

阳性对照未检出 → 重复实验。

内参照未扩增 → 样本可能存在抑制物，需重新提取DNA。

性能参数

| 指标 | 性能 |

| 检测限（LOD） | 10 拷贝/反应 |

| 特异性 | 不与B、C、D、E、F型肉毒毒素基因交叉 |

| 重复性 | CV < 5%（n=10） |

| 扩增效率 | 90%~110% |

注意事项

生物安全警告：

肉毒梭菌为 生物安全等级2级（BSL-2）病原体，操作需在生物安全柜中进行。

阳性对照含灭活DNA，仍须按感染性材料处理。

实验要求：

分区操作（试剂准备区、样本处理区、扩增区）。

使用无核酸酶枪头/离心管，避免气溶胶污染。

储存与稳定性：

未开封试剂有效期：-20℃避光保存12个月。

解冻后Master Mix限当日使用。

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