亨德拉病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

预期用途

本试剂盒基于荧光探针法（TaqMan）原理，用于定性检测动物组织（如蝙蝠、马匹）、患者血清/脑脊液或环境样本中亨德拉病毒（Hendra virus, HeV）的RNA。适用于：

动物疫情监测与早期诊断

人类疑似病例实验室确认

科研及流行病学调查

注意：本试剂需在生物安全三级（BSL-3）或以上实验室操作，实验人员需具备相应资质。

检测原理

RNA提取：样本中病毒RNA经纯化后作为模板。

反转录（RT）：逆转录酶将RNA转化为cDNA。

荧光定量PCR：

特异性引物：靶向HeV高度保守的N（核蛋白）或M（基质蛋白）基因区域。

荧光染料：采用非特异性染料（如SYBR Green I），与双链DNA结合后释放荧光信号。

实时监测：每轮PCR循环采集荧光值，通过Ct值（扩增阈值循环数）判定病毒载量。

试剂盒组分

| 组分 | 规格 | 保存条件 |

| 2× RT-PCR预混液 | 1.25 mL | -20℃避光 |

| 逆转录酶 | 100 μL | -20℃ |

| RNase抑制剂 | 50 μL | -20℃ |

| HeV引物混合液（干粉） | 1管 | -20℃ |

| DEPC处理水 | 1.5 mL | 室温 |

| 阳性对照（HeV RNA） | 50 μL | -70℃ |

| 阴性对照（无核酸水） | 1 mL | -20℃ |

样本要求

| 样本类型 | 处理建议 | 保存条件 |

| 动物组织（肺、脑） | 匀浆后取上清 | -70℃ ≤72h |

| 血清/脑脊液 | 直接提取或稀释 | 2~8℃ ≤24h |

| 环境拭子 | 浸泡于病毒保存液 | -70℃长期 |

操作步骤

RNA提取

使用商业RNA提取试剂盒（如QIAamp Viral RNA Mini Kit）。

反应体系配制（25 μL）

2× RT-PCR预混液   12.5 μL  

引物混合液          2.0 μL  

逆转录酶           0.5 μL  

RNase抑制剂        0.25 μL  

RNA模板            5.0 μL  

DEPC水             补至25 μL  

PCR程序设置

| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | 信号采集 |

| 逆转录 | 50℃ | 15 min | 1 | - |

| 预变性 | 95℃ | 3 min | 1 | - |

| 扩增 | 95℃ 10s → 60℃ 30s | 40 | ✔（60℃结束时） |

结果判读

有效性判定

阴性对照：Ct值≥40或无扩增曲线

阳性对照：Ct值≤35（典型值28~32）

样本判定

阳性：Ct值≤38，且扩增曲线呈S型

可疑：Ct值38~40，建议复测

阴性：Ct值≥40或无扩增

性能参数

| 指标 | 性能 |

| 检测限（LoD） | 10 copies/μL（95%阳性率） |

| 特异性 | 无交叉反应（尼帕病毒、狂犬病毒等） |

| 重复性 | CV ≤5%（同一批次） |

注意事项

生物安全

实验全程在BSL-3实验室进行，废弃物需高压灭菌。

阳性对照使用后立即密封存储于-70℃。

实验操作

分区操作（试剂准备区→样本处理区→扩增区）

避免RNase污染，使用无核酸酶耗材

储存与运输

-20℃避光保存（避免反复冻融＞3次）

干冰运输

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