核型多角体病毒染料法荧光定量PCR试剂盒

产品基本信息

中文名称：核型多角体病毒染料法荧光定量PCR试剂盒

英文名称：Nuclear Polyhedrosis Virus (NPV) Dye-based Fluorescent Quantitative PCR Kit

检测靶基因：NPV基因组高度保守区（如多角体蛋白基因 polh 或晚期表达因子基因 lef-8）

检测原理：SYBR Green I染料特异性掺入DNA双链后发出荧光，通过实时监测荧光信号实现病毒核酸定量

适用样本类型及前处理要点

样本类别 具体样本示例 前处理关键步骤

昆虫组织样本 感染幼虫的中肠、体壁、血淋巴匀浆 ① 取50mg组织加DNA病毒裂解液（含蛋白酶K），56℃消化30分钟

② 13000rpm离心5min取上清，煮沸裂解法（100℃ 10min）释放DNA

环境与生物防治样本 病毒杀虫剂制剂、感染病毒的昆虫尸体、植物叶面擦拭物 ① 制剂样本用生理盐水10倍稀释，8000rpm离心3min取沉淀

② 植物叶面用无菌棉签擦拭，洗脱液经0.22μm滤膜过滤后提取DNA

实验室培养物 昆虫细胞培养液、病毒多角体结晶 直接取上清50μL，加入1% SDS破坏多角体结构，磁珠法纯化DNA

性能参数

灵敏度：100拷贝/反应（线性范围10¹–10⁶拷贝/μL，参考斜纹夜蛾NPV试剂盒数据）

特异性：与质型多角体病毒（CPV）、颗粒体病毒（GV）等无交叉反应

重复性：批内CV<3%，批间CV<5%（n=8次重复实验）

反应时间：全程约2小时（含样本前处理30分钟+PCR扩增1.5小时）

试剂盒组成

组分 规格 用途

2×qPCR Magic Mix 500μL（棕色管） 含热启动DNA聚合酶、dNTP、SYBR Green I染料

NPV引物混合液 100μL (10μM) 扩增靶基因保守区（如 polh 基因）

阳性对照（质粒DNA） 50μL (1×10⁸ copies/μL) 验证反应有效性（无传染性片段）

荧光PCR专用模板稀释液 1mL（黄盖） 阳性对照梯度稀释

DNA病毒裂解液（试用装） 9mL 快速裂解病毒释放DNA

关键操作要点

样本采集与保存：

昆虫幼虫样本需液氮速冻后-80℃保存，避免反复冻融导致病毒粒子破裂；

病毒制剂样本需4℃避光保存，使用前需涡旋混匀（多角体易沉淀）。

反应体系与程序（20μL体系）：

① 试剂混合（冰上操作）：

  2×qPCR Magic Mix 10μL + 引物混合液 2μL + 模板DNA 5μL + 无酶水 3μL  

② 扩增程序：

  95℃预变性 10分钟 → 40循环（95℃ 15秒 → 60℃ 1分钟，采集荧光）→ 溶解曲线分析（65℃→95℃，每0.5℃停留5秒）

结果判读标准：

阳性：Ct≤35且溶解曲线单一峰值（Tm=85±1℃）；

可疑：35<Ct<38，需用柱提法重新提取DNA验证；

阴性：Ct≥38或无扩增（需同时满足阴性对照Ct≥40）

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