铅黄肠球菌染料法荧光定量PCR试剂盒
商品属性
产品名称 | 铅黄肠球菌染料法荧光定量PCR试剂盒 | 英文名称 | Enterococcus casseliflavus Dye-based qPCR Kit |
规格 | 50T | 货号 | PR3628 |
检测原理
基于SYBR Green I荧光染料法，通过特异性引物扩增铅黄肠球菌EF0686基因保守区域（长度：152bp），实时监测荧光信号强度，实现对靶标DNA的定量检测。
应用范围
临床标本（血液、尿液、组织）中铅黄肠球菌的快速筛查
食品/环境样品微生物污染监测
耐药菌株（如万古霉素耐药表型）的辅助鉴定
组分清单（50T）
| 组分 | 体积/数量 | 保存条件 |
| qPCR Master Mix (2×) | 1.25 mL | -20℃避光 |
| E. casseliflavus 特异性引物混合液 | 100 μL | -20℃ |
| DNA提取试剂（裂解液+蛋白酶K） | 各1支 | 室温/-20℃ |
| 阳性对照（重组质粒，10⁴ copies/μL） | 50 μL | -20℃ |
| 阴性对照（无核酸水） | 1 mL | 室温 |
| RNase-Free Water | 1 mL | 室温 |
技术要求
| 参数 | 性能指标 |
| 灵敏度 | ≤ 10 copies/反应 |
| 线性范围 | 10¹~10⁷ copies/μL（R²≥0.99） |
| 特异性 | 不检出：粪肠球菌(E. faecalis)、屎肠球菌(E. faecium)、金黄色葡萄球菌等20种常见病原体 |
| 扩增效率 | 90%~110% |
| 批内精密度 | CV≤5% |
| 批间精密度 | CV≤8% |
操作流程
1. DNA提取（以血液样本为例）
① 取200 μL样本 + 20 μL蛋白酶K + 200 μL裂解液 → 56℃ 30 min
② 95℃ 10 min灭活 → 12,000 rpm离心5 min → 取上清作为模板
2. qPCR反应体系配制（20 μL体系）
| 组分 | 用量 |
| 2× Master Mix | 10 μL |
| 引物混合液 | 0.8 μL |
| DNA模板 | 2 μL |
| RNase-Free Water | 补至20 μL |
3. 扩增程序（ABI 7500仪器）
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | 信号采集 |
| 预变性 | 95℃ | 5 min | 1 | 无 |
| 扩增 | 95℃ | 15 sec | 40 | 每轮结束 |
| | 60℃ | 45 sec | | |
| 熔解曲线 | 60℃→95℃ | 每0.3℃升温 | 1 | 连续采集 |
结果判读标准
阳性：Ct值≤35，且熔解曲线为单峰（Tm=83.5±0.5℃）
可疑：Ct值35-38 → 建议重复检测
阴性：无Ct值或Ct≥38
注意事项
⚠️ 操作全程需在PCR洁净台中进行，穿戴无菌手套
⚠️ 熔解曲线出现多峰提示非特异性扩增 → 需优化模板浓度
⚠️ 试剂反复冻融≤3次，避免荧光信号衰减
⚠️ 阳性对照Ct值应在28±2范围内
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