抗性淀粉和非抗性淀粉含量（酶法）试剂盒
（分光法 48样）
一、产品简介：
本试剂盒利用α-胰淀粉酶和淀粉葡糖苷酶使非抗性淀粉水解成D-葡萄糖，剩余的沉淀即为样品中的抗性淀粉，利用强碱溶液溶解抗性淀粉，再利用淀粉葡糖苷酶将其进一步水解成葡萄糖。通过检测葡萄糖含量得到非抗性淀粉和抗性淀粉的含量。
二、试剂盒的组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 液体35mL×1瓶 | 4℃保存 |
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试剂二 | 粉剂mg×1瓶 | 4℃保存 | 临用前甩几下使粉剂落入底部，加22mL 试剂一持续混匀5min，再加0.02mL 试剂七混合，4000rpm离心10min，取上清保存备用。 |
试剂三 | 自备 | 4℃保存 | 50%乙醇：45mL 无水乙醇加入45mL蒸馏水，混匀，备用。 |
试剂四 | 液体12mL×1瓶 | 4℃保存 |
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试剂五 | 自备0.5L | 4℃保存 | 0.1M乙酸-乙酸钠PH4.5（配制见附录） |
试剂六 | 液体45mL×1瓶 | 4℃保存 |
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试剂七 | 液体0.7mL×1支 | 4℃保存 | 用前甩几下使液体试剂落入底部。 |
试剂八 | 空瓶×1瓶 | 4℃保存 | 临用前加入0.16mL试剂七加5.64mL试剂一，混匀，备用。 |
试剂九 | 粉剂mg×2支 | 4℃保存 | 临用前甩几下使粉剂落入底部，每支再加3.6mL的蒸馏水溶解备用。 |
试剂十 | 液体65mL×1瓶 | 4℃保存 |
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标准品 | 粉体mg×1支 | 室温干燥保存 | 准确称取2mg标准品（葡萄糖）至一新EP管中，再加1mL试剂五充分溶解即得2mg/mL标准品，再用试剂五稀释4倍至0.5mg/mL备用。（该标准品粉体开封后也需干燥保存和使用） |
三、 所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL玻璃比色皿（光径1cm）、水浴锅、可调式移液器、研钵、乙醇、冰乙酸、乙酸钠、冰水浴和蒸馏水。
四、 抗性和非抗性淀粉含量测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！
1、 样本制备：
抗性淀粉待测液制备：
① 取1-5g样本烘干（50℃）至恒重，磨碎并过筛（如0.5mm筛）得到待检均匀粉末样本，取10mg粉末至2mLEP管中，（若样本含糖，需先除糖：向沉淀中加入1mL的80%乙醇，室温静置30min(间隔5min振荡混匀一次)，5000rpm室温离心10min，弃上清留沉淀，室温条件下待乙醇挥发完（也可用吸水纸除干净乙醇）（整个除糖过程不能高温）），再向EP管中加0.4mL 试剂二，涡旋，水平放置于震荡培养箱中，37℃、200rpm往复震荡培养16小时（下午4点至次日上午8点）
② 取出加入0.4mL无水乙醇，涡旋震荡，5000rpm室温离心10min，收集上清至10mL管子里。向沉淀中加入0.2mL 试剂三，涡旋，再加0.6mL 试剂三，涡旋混匀，5000rpm室温离心10min，小心收集全部上清液至10mL管子里，再重复操作一次。
③ 在冰浴条件下，向有沉淀的EP管中，一边用手震荡一边缓慢加入0.2mL 试剂四，震荡直到完全溶解，冰浴或者放置4℃冰箱10min。取出加入0.8mL 试剂六，颠倒混匀（不能涡旋），立即加入10μL试剂七混匀后，50℃孵育30min(间歇混匀5-6次）。
④ 孵育完成后冷却至室温，对于RS<10%的样本，直接3000rpm室温离心5min；RS>10%的样本，用蒸馏水稀释10倍后再离心。
非抗性淀粉待测液制备：
抗性淀粉检测液制备操作步骤②中收集到的上清液，用试剂五定容至10mL，即为非抗性淀粉待测液。
2、 上机检测：
① 可见分光光度计预热30min以上，调节波长至510nm，蒸馏水调零。
② 试剂八、九、十预先解冻至室温（25℃）。
③ 在EP管中依次加入：
试剂名称（μL） | 抗性淀粉 测定管 | 非抗性淀粉 测定管 | 空白管 （仅做一次） | 标准管 (仅做一次) |
| 30μL 抗性淀粉上清液 | 30μL 非抗性淀粉上清液 |
| 30μL 0.5mg/mL葡萄糖 |
试剂五 | 100 |
| 130 | 100 |
试剂八 |
| 100 |
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混匀，50℃下，避光温育20min |
试剂九 | 60 | 60 | 60 | 60 |
试剂十 | 650 | 650 | 650 | 650 |
混匀，50℃下，避光温育20min，全部液体转移至1mL玻璃比色皿（光径1cm），于510nm处读取吸光值A。 |
五、结果计算：
1、按样本干重计算：
抗性淀粉含量(mg/g干重)=(C标准×V3)×(A抗性淀粉-A空白)÷(A标准-A空白)
÷(W×V3÷V1)×D×162÷180
=0.505×(A抗性淀粉-A空白)÷(A标准-A空白)÷W×D×162÷180
非抗性淀粉含量(mg/g干重)=(C标准×V3)×(A非抗性淀粉-A空白)÷(A标准-A空白)
÷(W×V3÷V2)×162÷180
=5×(A非抗性淀粉-A空白)÷(A标准-A空白)÷W×162÷180
总淀粉含量(mg/g干重)=抗性淀粉含量+非抗性淀粉含量
V1---抗性淀粉待检液体积，1.01mL； V2---非抗性淀粉待检液体积，10 mL；
V3---显色反应中上清液体积，0.03mL； D---稀释倍数，未稀释即为1；
C标准---0.5mg/mL葡萄糖； W---样本质量，g。
附录：0.1M乙酸-乙酸钠PH4.5试剂配制：
A母液（0.2mol/L乙酸溶液）：量取5.775mL冰乙酸，稀释至500mL。
B母液（0.2mol/L乙酸钠溶液）：称取8.2g无水乙酸钠（Mr=82.04）或者13.61g三水合乙酸钠（Mr=136.09）溶解，定容至500mL。
取A母液51.0mL，B母液49.0mL，混合，用A母液调节PH值至4.5后，用蒸馏水定容至200mL。
（可根据实际需要量同比例缩小或扩增）
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