节状古柏线虫染料法荧光定量PCR试剂盒 新品

节状古柏线虫染料法荧光定量PCR试剂盒

商品属性

产品概述

本试剂盒采用优化的染料法 (SYBR Green I) 荧光定量PCR (qPCR) 技术，专为快速、灵敏、特异地检测节状古柏线虫 (Cooperia oncophora) DNA而设计。适用于从反刍动物（牛、羊等）粪便样本、环境样本或培养物中提取的基因组DNA的定量检测。该试剂盒包含预混的qPCR Master Mix、特异性引物、阳性对照和阴性对照，操作简便，结果可靠。

检测原理

特异性引物： 试剂盒提供针对节状古柏线虫特异性基因序列（如ITS-2, 18S rRNA等）设计的高效引物对。

SYBR Green I 染料： 该染料能特异性地嵌入双链DNA (dsDNA) 的小沟中。在游离状态下，其荧光信号非常微弱；一旦嵌入dsDNA，其荧光信号会显著增强。

实时荧光监测： PCR反应过程中，随着目标DNA片段的指数级扩增，反应体系中积累的dsDNA量不断增加，嵌入其中的SYBR Green I染料也随之增多，导致荧光信号强度成比例增强。

定量分析： 仪器实时监测每个循环结束时的荧光强度。通过分析荧光信号达到设定阈值 (Threshold) 所需的循环数 (Ct值)，结合标准曲线，即可对样本中初始的节状古柏线虫DNA模板进行定量分析。

熔解曲线分析： 反应结束后，仪器会缓慢升温并监测荧光信号变化。特定的扩增产物具有特定的熔解温度 (Tm值)。通过分析熔解曲线峰形和Tm值，可以确认扩增产物的特异性，区分非特异性扩增（如引物二聚体）。

试剂盒组分

| 组分名称 | 规格/数量 | 储存条件 | 主要功能 |

| 2× Dye-Based qPCR Master Mix | 1.0 mL × 1管 | -20℃ | 包含热启动Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂、SYBR Green I染料、稳定剂、优化缓冲液。 |

| Cooperia oncophora Specific Primer Mix (F+R) | 200 μL × 1管 | -20℃ | 针对节状古柏线虫的特异性引物对，预混。 |

| Positive Control (C. oncophora DNA) | 50 μL × 1管 | -20℃ | 已知浓度的节状古柏线虫基因组DNA，用于建立标准曲线和监控实验有效性。避免反复冻融，建议分装。 |

| Negative Control (Nuclease-Free Water) | 1 mL × 1管 | 室温/-20℃ | 无DNA/RNA酶水，作为模板空白对照。 |

| Nuclease-Free Water | 1 mL × 1管 | 室温 | 用于反应体系稀释或对照设置。 |

| [可选] ROX Passive Reference Dye | 如有，按规格提供 | -20℃ | 用于校正孔间荧光信号波动（适用于需要ROX校正的仪器）。 |

注：实际组分和规格请以收到的试剂盒内清单为准。

操作步骤

1. 试剂准备与解冻

从-20℃冰箱中取出试剂盒，置于冰上解冻。

解冻后，轻轻涡旋混匀各液体组分 (特别是Master Mix和Primer Mix)，并短暂离心使液体沉至管底。

计算所需反应数 (N)。建议包括：待测样本数 + 阳性对照 (1-2) + 阴性对照 (1-2) + (可选) 标准曲线点 (通常3-5个梯度，每个梯度建议2-3复孔)。N = 总反应数。

2. 配制预混液 (推荐方法，减少加样误差)

在一个无菌、无核酸酶的1.5 mL离心管中，按以下比例配制预混液 (以单反应20 μL体系为例)：

2× Dye-Based qPCR Master Mix: 10 μL × N

Cooperia oncophora Specific Primer Mix (F+R): 0.8 μL × N (终浓度通常为0.4 μM each，具体参考实际说明书)

Nuclease-Free Water: 补足至 (10 μL - 引物体积) × N (例如，若引物加0.8μL，则水加 10μL - 0.8μL = 9.2μL × N)

轻轻涡旋混匀预混液，避免产生气泡，短暂离心。

3. 分装与加样

将配制好的预混液按 19 μL/孔 分装到qPCR反应板/管的各孔中。

向各孔中加入对应的模板DNA：

待测样本孔： 加入 1 μL 提取的样本DNA。

阳性对照孔 (PC)： 加入 1 μL Positive Control DNA (按说明书要求稀释或直接使用)。

阴性对照孔 (NC)： 加入 1 μL Negative Control (Nuclease-Free Water)。

[可选] 标准曲线孔： 加入 1 μL 系列稀释的阳性对照DNA (例如：10^0, 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4 拷贝/μL 或 ng/μL)。

注意： 每个样本/对照建议设置至少2个技术重复。

盖紧光学封膜，确保密封良好。短暂离心，使液体沉至管底并去除气泡。

4. qPCR 反应程序设置

在荧光定量PCR仪上设置以下循环程序（具体参数需根据引物Tm值和仪器性能优化，以下为通用示例）：

| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | 采集模式 | 说明 |

| 1. 预变性 | 95℃ | 3-5 min | 1 | 不采集或终点采集 | 激活热启动酶，彻底变性。 |

| 2. 循环扩增 | 95℃ | 10-15 sec| 40-45 | 不采集 | 变性。 |

| | 60-65℃ | 30-60 sec | | 采集荧光 | 退火/延伸 (SYBR通道)。关键步骤！温度需优化。 |

| 3. 熔解曲线 | 95℃ | 15 sec | 1 | 不采集 | |

| | 60℃ | 1 min | | 不采集 | |

| | 95℃ | 连续采集 | | 连续采集荧光 | 以0.3-0.5℃/sec升温速率，采集SYBR通道荧光。用于分析产物特异性。 |

| 4. [可选] 冷却 | 40℃ | 30 sec | 1 | 不采集 | |

退火/延伸温度： 这是最关键的需要优化的参数，通常在引物Tm值减5℃到Tm值之间。请参考引物设计信息或进行梯度PCR确定最佳温度。示例中60-65℃仅为范围提示。

采集通道： 选择SYBR Green I (FAM/SYBR) 对应的荧光通道。

5. 运行程序

将装有反应体系的反应板/管放入qPCR仪中。

启动程序运行。

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