斑点病密螺旋体染料法荧光定量PCR试剂盒 新品

斑点病密螺旋体染料法荧光定量PCR试剂盒

商品属性

产品用途

本试剂盒采用 SYBR Green I 荧光染料法，通过实时荧光定量PCR（qPCR）技术，定性检测兔组织、生殖器拭子、皮损渗出液等样本中的 斑点病密螺旋体（Treponema paraluiscuniculi）特异性DNA。适用于兔螺旋体病（兔梅毒）的实验室诊断、流行病学调查及病原监控。

检测原理

核酸提取：样本中DNA经柱式或磁珠法提取纯化。

qPCR扩增：

使用特异性引物扩增 T. paraluiscuniculi 保守基因片段（如 tpp47 基因或16S rRNA基因）。

SYBR Green I 染料嵌入双链DNA中，在激发光下释放荧光信号，荧光强度与产物量成正比。

结果判定：根据扩增曲线、熔解曲线（Tm值）及Ct值（阈值循环数）判断样本中是否含目标病原。

试剂盒组分（48 Tests）

| 组分名称 | 体积/数量 | 储存条件 |

| qPCR Premix (2×) | 1.25 mL × 2 管 | -20℃避光 |

| T. paraluiscuniculi 引物混合液 | 150 μL × 1 管 | -20℃ |

| 阳性对照（基因组DNA） | 50 μL × 1 管 | -20℃ |

| 阴性对照（无核酸水） | 1 mL × 1 管 | -20℃ |

| RNase-Free Water | 1 mL × 1 管 | 室温 |

适用仪器

所有主流荧光定量PCR仪：

Bio-Rad CFX系列、Applied Biosystems QuantStudio系列、Roche LightCycler® 480、Thermo Fisher StepOnePlus™等。

样本要求

| 样本类型 | 采集/保存方法 | 建议用量 |

| 生殖器/皮损拭子 | 无菌棉签采集，置于1 mL PBS或生理盐水中 | 200 μL |

| 组织（皮肤、淋巴结等） | 无菌采集，-80℃或RNAlater保存 | 20–30 mg |

| 全血/血清 | EDTA抗凝管采集，-20℃保存 | 200 μL |

注意：避免样本反复冻融，提取前需充分匀浆/离心。

检测流程

DNA提取（推荐试剂盒）：

使用商业DNA提取试剂盒（如QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit）。

洗脱体积：50–100 μL。

qPCR反应体系配制（20 μL/反应）：

| 组分                | 体积    |  

| 2× qPCR Premix      | 10 μL  |  

| 引物混合液          | 0.8 μL  |  

| 模板DNA             | 2–5 μL  |  

| RNase-Free Water    | 补至20 μL |  

qPCR程序设置：

阶段     温度       时间        循环数  

预变性   95℃       5 min       1  

扩增     95℃       10 sec      40  

         60℃       30 sec  

         72℃       15 sec（采集SYBR荧光）  

熔解曲线  65℃→95℃  每0.5℃升温5 sec |  

结果判读

阳性：

Ct值 ≤ 35.0，且熔解曲线Tm值符合预期（例如：85.0±1.5℃）。

可疑：

Ct值 35.1–38.0，需重复检测确认。

阴性：

无扩增曲线（Ct值 Undetected）。

质控要求：

阳性对照：Ct ≤ 30.0

阴性对照：无扩增信号

性能指标

| 参数 | 性能 |

| 检测限（LoD） | 10 拷贝/反应 |

| 特异性 | 不扩增兔其他病原及共生微生物 |

| 重复性 | CV ≤ 5% (Ct值) |

| 线性范围 | 10²–10⁸ 拷贝/μL (R²>0.99) |

注意事项

储存：-20℃避光保存，避免反复冻融（≤3次）。

污染控制：PCR分区操作（样本处理区、配制区、扩增区），使用紫外灯及酶清洁剂。

生物安全：阳性对照含失活DNA，仍须按II类病原体处理废弃物。

验证：首次使用前建议用标准品验证扩增效率（90–110%）。

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