羧酸酯酶（CarE）测试盒

羧酸酯酶（CarE）测试盒

测定意义与原理

测定意义

哺乳动物CarE，也称脂族酯酶（aliesterase），广泛分布于组织和器官，属于丝氨酸水解酶家族，其测定具有重要的临床和科研价值：临床诊断：诊断和监测肝脏疾病、肾脏疾病、有机磷农药中毒等毒理学研究：评估环境毒物和致癌物的解毒代谢机制农业研究：研究农药残留对生物的影响生物学研究：了解脂质运输和代谢途径

测定原理

CarE能催化乙酸-1-萘酯生成萘酯，固蓝显色；在450nm检测光吸收速率来监测萘酯生成速率，从而计算CarE活性。反应式如下： 乙酸-1-萘酯→CarE1-萘酚+乙酸乙酸-1-萘酯CarE1-萘酚+乙酸 1-萘酚+固蓝→蓝色复合物1-萘酚+固蓝→蓝色复合物

试剂盒组成

分光光度法/比色法试剂盒

组分 规格 作用说明

试剂一 液体×1瓶 含Tris-HCl缓冲液（pH8.0），用于提取样本中的CarE

试剂二 液体×1瓶(棕色) 含乙酸-1-萘酯溶液，反应底物

试剂三 粉剂×2支 含固蓝溶液，显色剂

试剂四 粉剂×1支 含缓冲液，调节反应pH值

标准品 液体1mL×1支 含羧酸酯酶标准品，用于建立标准曲线

ELISA法试剂盒

组分 规格 作用说明

包被板 96孔×1块 预包被抗CarE单克隆抗体

酶标抗体 液体6mL×1瓶 含HRP标记抗CarE抗体

标准品 液体1mL×2瓶 含0、2、4、8、16、32U/L CarE标准品

底物液 液体6mL×1瓶 含TMB底物液，显色反应试剂

终止液 液体6mL×1瓶 含2mol/L H₂SO₄溶液，终止显色反应

自备仪器与试剂

必备仪器

分光光度法/比色法：可见光分光光度计（450nm检测通道）、1mL玻璃比色皿

微量法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板

ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板、洗板机

通用：低温离心机（≥10000g）、恒温水浴锅、可调式移液器、电子天平、研钵

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器

自备试剂：蒸馏水/去离子水、无水乙醇、三氯乙酸

样本前处理方法

细菌/细胞样品收集：收集200万细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清破碎：按照每200万细菌或细胞加入400μL试剂一，超声波破碎（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：12000g 4℃离心30min，取上清液待测保存：若不立即测定，上清液需置于-20℃冷冻保存

组织样品取样：称取约0.1g组织，用蒸馏水洗净表面杂质，用滤纸吸干匀浆：按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆离心：12000g 4℃离心30min，取上清液待测测定蛋白浓度：测定组织样本时需要同时测定蛋白浓度

液体样品（血清/尿液/脑脊液）血清/血浆：直接测定；若浓度过高，用提取液稀释10-20倍尿液：离心去除沉淀，取上清液测定；或用提取液稀释10-20倍脑脊液：无菌采集，离心去除沉淀，取上清液测定

测定操作步骤

分光光度法/比色法操作仪器预热：分光光度计预热30min以上，调节波长到450nm，用蒸馏水调零试剂配制：

临用前取1支试剂三加1.2ml无水乙醇充分溶解

临用前取试剂二1瓶，取少量试剂二加入到1支试剂四中溶解，然后把溶解的1支试剂四和1支试剂三加入到该瓶试剂二中，混匀充分，过滤，4°C避光保存，可用1周工作液预热：工作液在37°C中预热30min以上空白管测定：

依次在1ml玻璃比色皿中依次加入5μl蒸馏水，1000μl预热的工作液，迅速混匀后在450nm测定10s和190s光吸收A1和A2

△A空白管=A2-A1（空白管只需做1-2次）测定管测定：

依次在1ml玻璃比色皿中依次加入5μl上清液，1000μl预热的工作液，迅速混匀后在450nm测定10s和190s光吸收A3和A4

△A测定管=A4-A3标准曲线绘制：

将标准品稀释成0、2、4、8、16、32U/L系列浓度

同样处理，测定3min内吸光值变化，绘制标准曲线

ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟加样：每孔加入样本或标准品50μL，37℃孵育30min洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）酶标抗体：每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，37℃孵育60min洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度

结果计算方法

单位定义

U/mg prot：每毫克组织蛋白每分钟催化生成1μmol产物的酶量

U/g 鲜重：每克鲜重样本每分钟催化生成1μmol产物的酶量

U/L：每升样本每分钟催化生成1μmol产物的酶量

分光光度法/比色法计算公式

CarE活性(U/mg prot)=(ΔA测定管−ΔA空白管)×V反总Cpr×V样×ε×d×T×106CarE活性(U/mg prot)=Cpr×V样×ε×d×T(ΔA测定管−ΔA空白管)×V反总×106

ΔA测定管：测定管吸光度变化值

ΔA空白管：空白管吸光度变化值

V反总：反应体系总体积（L）

Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）

V样：样本体积（L）

ε：摩尔消光系数（L/mol/cm）

d：比色皿光径（cm）

T：反应时间（min）

ELISA法计算公式

CarE含量(U/L)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数CarE含量(U/L)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数

性能指标

指标 分光光度法/比色法 ELISA法

线性范围 0~32U/L 0~64U/L

最低检测限 ≤0.1U/L ≤0.1U/L

回收率 90%~110% 90%~110%

批内精密度 CV≤5.0% CV≤10%

批间精密度 CV≤8.0% CV≤15%

稳定性 2-8℃保存12个月 2-8℃保存6个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免CarE失活；-20℃可保存3个月

组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活

液体样本需避免溶血和细菌污染

试剂使用：

试剂二需4℃避光保存，收货后一周内完成测定

粉剂试剂需临用前配制，溶解后4℃保存一周

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

分光光度法反应温度需严格控制在37℃，反应时间180秒

ELISA法需严格控制温育时间和温度，避免影响显色反应

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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