转氢酶2测试盒
测定意义与原理
测定意义
转氢酶（TH）位于线粒体的内膜上，又称为线粒体复合体六，催化NADH+NADP+和NAD++NADPH相互转化，调节线粒体NAD(H)和NADP(H)平衡。其中，逆向反应（TH-2）催化NADPH和NAD+生成NADP+和NADH，其活性测定具有重要的临床和科研价值：临床诊断：诊断和监测线粒体疾病、神经系统疾病、心血管疾病等疾病监测：评估细胞能量代谢状态、组织损伤程度和治疗效果生物学研究：了解线粒体功能、细胞凋亡和细胞增殖机制环境监测：评估环境污染对生物线粒体的影响药物研发：筛选线粒体靶向药物，用于治疗线粒体疾病和神经退行性疾病
测定原理
NADH和NADPH均在340nm有特征吸收，因此TH催化的转氢反应不能导致340nm吸光度发生变化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(APAD+)替代NAD+，TH-2催化APAD+还原生成APADH，APADH在375nm有特征光吸收，测定375nm光吸收的增加速率，来计算TH-2活性。反应式如下： NADPH+APAD+→TH-2NADP++APADHNADPH+APAD+TH-2NADP++APADH
试剂盒组成
组分 规格 作用说明
试剂一 25mL×1瓶 含碱性提取液，用于提取样本中的转氢酶
试剂二 5mL×1瓶 含NADPH溶液，反应底物
试剂三 1.5mL×1支 含APAD+溶液，人工合成反应底物
试剂四 粉剂×1支 含激活剂，用于提高转氢酶活性
试剂五 0.7mL×1支 含稳定剂，用于稳定反应体系
试剂六 10mL×1瓶 含缓冲液，用于提供适宜的反应pH环境
自备仪器与试剂
必备仪器
紫外分光光度法：紫外分光光度计、1mL玻璃比色皿
微量法：酶标仪、96孔板
通用：台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水
必备耗材
离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器
自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、三氯乙酸
样本前处理方法
动植物组织样本取样：准确称取0.1g组织，用生理盐水洗净表面杂质，用滤纸吸干匀浆：加入1mL试剂一和10μL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆低速离心：600g，4℃离心5min，弃沉淀，保留上清液高速离心：11000g，4℃离心10min，弃上清液，沉淀即为线粒体线粒体裂解：沉淀中加入200μL试剂二和2μL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）检测：裂解液用于TH-2酶活性测定
细胞样本收集：收集500万细胞到离心管内，离心后弃上清破碎：加入1mL试剂一和10μL试剂三，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测
血清/血浆样本
血清/血浆样本可直接检测；若浓度过高，用提取液稀释10-20倍
测定操作步骤
紫外分光光度法操作仪器预热：分光光度计预热30min以上，调节波长到375nm，用蒸馏水调零工作液配制：临用将试剂五转移到试剂四中混合溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融工作液预热：将工作液置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min样品测定：
取1mL玻璃比色皿，加入0.9mL工作液和0.1mL样本溶液，迅速混匀
立即在375nm测定0min和1min的光吸收值A1和A2，计算ΔA=A2-A1标准曲线绘制：
将标准品稀释成0、10、20、30、40、50U/L系列浓度
同样处理，测定1min内吸光值变化，绘制标准曲线
微量法操作仪器预热：酶标仪预热30min以上，调节波长到375nm工作液配制：同上工作液预热：同上样品测定：
取100μL样本溶液，加入100μL工作液，迅速混匀
立即在375nm测定0min和1min的光吸收值A1和A2，计算ΔA=A2-A1标准曲线绘制：同上
结果计算方法
单位定义
U/mg prot：每毫克组织蛋白每分钟催化生成1μmol APADH的酶量
U/g 鲜重：每克鲜重样本每分钟催化生成1μmol APADH的酶量
U/L：每升样本每分钟催化生成1μmol APADH的酶量
计算公式
TH-2活性(U/mg prot)=ΔA×V总Cpr×V样×ε×d×T×106TH-2活性(U/mg prot)=Cpr×V样×ε×d×TΔA×V总×106
ΔA：1min内吸光度变化值
V总：反应体系总体积（L）
Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）
V样：样本体积（L）
ε：APADH摩尔消光系数（L/mol/cm）
d：比色皿光径（cm）
T：反应时间（min）
性能指标
指标 紫外分光光度法 微量法
线性范围 0~50U/L 0~50U/L
最低检测限 ≤0.1U/L ≤0.1U/L
回收率 90%~110% 90%~110%
批内精密度 CV≤5.0% CV≤5.0%
批间精密度 CV≤8.0% CV≤8.0%
稳定性 2-8℃保存6-12个月 2-8℃保存6-12个月
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免转氢酶失活；-20℃可保存3个月
操作过程需在4℃冰浴中进行，避免线粒体损伤
线粒体提取过程中需保持低渗环境，避免线粒体肿胀破裂
试剂使用：
APAD+溶液需避光保存，避免氧化失效
不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线
工作液临用前配制，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融
测定过程：
反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）
加入样品启动反应后3秒内即刻比色测定，确保数据准确
若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定
质量控制：
每次实验需设置空白对照和质控样本
定期校准仪器，确保检测结果准确性
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确
其他注意事项：
本产品仅供科研研究使用，不得用于人体临床直接检测
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作
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