商品属性
产品名称 | 乙醇脱氢酶（ADH）测试盒 | 产品货号 | BH-961111 |
规格 | 100管/96样、50管/48样 | 产品分类 | 辅酶Ⅰ系列 |
测试方法 | 微量法、紫外分光光度法 | 用途 | 仅供科研实验 |
测定意义与原理
测定意义
乙醇脱氢酶（ADH，EC1.1.1.1）是氧化还原酶家族成员，核心功能包括：酒精代谢：催化乙醇氧化为乙醛，是人体酒精解毒的关键酶能量代谢：参与NADH/NAD+平衡调节，维持细胞氧化还原稳态工业应用：用于酿酒、生物燃料生产、食品发酵等领域的工艺优化临床价值：血清ADH活性异常与肝脏疾病、酒精中毒、肿瘤等密切相关
测定原理
ADH催化乙醇氧化为乙醛，同时将NAD+还原为NADH，通过监测340nm处吸光度的上升速率计算酶活性： 乙醇+NAD+→ADH乙醛+NADH+H+乙醇+NAD+ADH乙醛+NADH+H+ NADH在340nm处有特征吸收峰，吸光度每分钟增加量与ADH活性成正比。
自备仪器与试剂
必备仪器
紫外分光光度计/酶标仪（340nm检测通道）
台式高速离心机（≥12000g）
恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）
可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）
超声破碎仪（用于细胞/酵母样本）
必备耗材
1mL石英比色皿（光径1cm）/96孔紫外板
离心管（1.5mL、10mL）
一次性无菌吸头
研钵/组织匀浆器（冰浴专用）
自备试剂
蒸馏水/去离子水
生理盐水（0.85% NaCl）
无水乙醇（分析纯）
样本前处理方法
组织样本取新鲜组织（如肝脏），用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分称取0.1g组织，加入1mL预冷提取液，冰浴匀浆12000g 4℃离心15min，取上清液置冰上待测若酶活性过高，可用提取液稀释1-5倍后测定
血清/血浆样本血液凝固后3000g 4℃离心10min，取血清上清血浆样本需加入抗凝剂（肝素/EDTA）后离心分离样本可直接检测，无需提取处理；活性过高时可用生理盐水稀释
细胞/酵母样本收集对数生长期细胞/酵母，8000g 4℃离心5min弃上清加入1mL预冷提取液重悬，冰浴超声破碎（功率20%，超声3s/间隔10s，重复30次）12000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测
测定操作步骤
紫外分光光度法操作
试剂准备：
试剂一（提取液）：直接使用
试剂二（NAD+溶液）：使用前用蒸馏水稀释10倍
试剂三（乙醇溶液）：用蒸馏水配制成0.1mol/L浓度
空白管设置：
比色皿中加入：提取液950μL + 稀释后NAD+溶液30μL + 蒸馏水20μL
37℃预温育5min，记录340nm处初始吸光度A0
样本测定：
另取比色皿，加入：提取液950μL + 稀释后NAD+溶液30μL + 样本20μL
37℃预温育5min，加入乙醇溶液20μL立即混匀
分别记录0min（A1）、1min（A2）、2min（A3）时的吸光度
计算ΔA：ΔA = [(A2 - A1) + (A3 - A2)] / 2
微量法（酶标仪）操作96孔板每孔加入：提取液95μL + 稀释后NAD+溶液3μL + 样本2μL37℃预温育5min，加入乙醇溶液2μL立即混匀设置动力学模式，340nm处连续读取10个循环（每6s读取1次）计算吸光度上升速率（ΔA/min）
酶活力计算方法
单位定义
U/g鲜重：每g组织鲜重每分钟催化生成1μmol NADH的酶量
U/mL：每mL样本每分钟催化生成1μmol NADH的酶量
U/mgprot：每mg蛋白每分钟催化生成1μmol NADH的酶量
计算公式
ADH活性(U/g鲜重)=ΔA×V反总×V样总ε×d×W×T×V样测ADH活性(U/g鲜重)=ε×d×W×T×V样测ΔA×V反总×V样总
ΔA：1min内吸光度变化值
V反总：反应体系总体积（1.0mL）
V样总：样本提取液总体积（mL）
ε：NADH摩尔消光系数（6.22×10³ L/(mol·cm)）
d：比色皿光径（1cm）
W：组织鲜重（g）
T：反应时间（1min）
V样测：测定时加入样本体积（0.02mL）
简化公式
组织样本：ADH（U/g鲜重）= 80.4 × ΔA ÷ W
血清样本：ADH（U/mL）= 80.4 × ΔA
蛋白样本：ADH（U/mgprot）= 80.4 × ΔA ÷ Cpr （Cpr为蛋白浓度，mg/mL）
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免酶失活；-80℃可保存1个月
匀浆与超声破碎需在冰浴中进行，控制温度在0-4℃
肝脏组织样本需去除血液，避免血红蛋白干扰
试剂使用：
NAD+溶液对光敏感，需避光保存
乙醇溶液需现配现用，避免挥发
试剂配制后需检查pH值（8.8±0.2）
测定过程：
反应温度严格控制在37℃（哺乳动物样本）或25℃（植物样本）
若ΔA值大于0.4，需稀释样本后重新测定
每个样本需设置3个平行孔，取平均值计算
质量控制：
每次实验设置空白对照（提取液替代样本）和阳性对照（已知活性ADH酶）
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质、样本处理是否正确
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