商品属性
产品名称 | NAD苹果酸酶（NADME）测试盒 | 产品货号 | BH-961121 |
规格 | 100管/96样、50管/48样 | 产品分类 | 辅酶Ⅱ系列 |
测试方法 | 微量法、紫外分光光度法 | 用途 | 仅供科研实验 |
测定意义与原理
测定意义
NAD苹果酸酶（NAD-ME）是苹果酸代谢的关键酶，主要功能包括：生物合成：催化苹果酸氧化脱羧生成丙酮酸和NADH，为脂肪酸、胆固醇等生物合成提供还原力能量代谢：参与三羧酸循环，调节细胞内能量平衡抗氧化防御：NADH作为谷胱甘肽还原酶的辅酶，维持细胞氧化还原稳态逆境响应：在干旱、高温、盐胁迫等逆境条件下，NAD-ME活性显著增加，增强细胞抗氧化能力疾病关联：NAD-ME活性异常与肿瘤、糖尿病、心血管疾病等密切相关
测定原理
NAD-ME催化苹果酸氧化脱羧反应： 苹果酸+NAD+→NAD-ME丙酮酸+CO2+NADH+H+苹果酸+NAD+NAD-ME丙酮酸+CO2+NADH+H+ NADH在340nm处有特征吸收峰，通过监测吸光度上升速率计算NAD-ME活性。
自备仪器与试剂
必备仪器
紫外分光光度计/酶标仪（340nm检测通道）
台式高速离心机（≥8000g）
恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）
可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）
超声破碎仪（用于细胞/细菌样本）
必备耗材
1mL石英比色皿/微量石英比色皿/96孔板
离心管（1.5mL、10mL）
一次性无菌吸头
研钵/组织匀浆器（冰浴专用）
自备试剂
蒸馏水/去离子水
生理盐水（用于样本稀释）
液氮（用于样本速冻）
样本前处理方法
动植物组织样本取新鲜组织，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分称取0.1g组织，加入1mL预冷提取液，冰浴匀浆8000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测若酶活性过高，可用提取液稀释1-5倍后测定
血清/血浆样本血清样本：血液凝固后3000g 4℃离心10min，取血清上清血浆样本：加入抗凝剂（肝素/EDTA）后3000g 4℃离心10min，取上清样本可直接检测，无需提取处理；活性过高时可用生理盐水稀释
细胞/细菌样本收集对数生长期细胞/细菌，8000g 4℃离心5min弃上清加入1mL预冷提取液重悬，冰浴超声破碎（功率20%，超声3s/间隔10s，重复30次）8000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测
测定操作步骤
紫外分光光度法操作
试剂准备：
试剂一：液体15mL×1瓶，4℃保存
试剂二：粉剂×1支，4℃保存，用时加550μL蒸馏水溶解
试剂三：粉剂×1支，-20℃保存，用时加550μL蒸馏水溶解（现配现用）
检测工作液：用时在试剂三中加入15mL试剂一和1mL蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融
预温育：
分光光度计预热30min，调节波长至340nm，蒸馏水调零
检测工作液置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴中预热10min以上
反应启动：
取比色皿，依次加入：工作液1.6mL + 试剂二0.05mL + 样本0.05mL
混匀，在340nm波长下记录20s时的初始吸光度A1和1min20s时的吸光度A2
计算ΔA：ΔA = A2 - A1
微量法（酶标仪）操作96孔板每孔加入：工作液160μL + 试剂二5μL + 样本5μL37℃预温育5min，加入样本后立即混匀设置动力学模式，340nm处连续读取10个循环（每1min读取1次）计算吸光度增加速率（ΔA/min）
酶活力计算方法
单位定义
U/mL：每mL样本每分钟生成1nmol NADH的酶量
U/mgprot：每mg蛋白每分钟生成1nmol NADH的酶量
U/g鲜重：每g组织鲜重每分钟生成1nmol NADH的酶量
计算公式
NAD-ME活性(U/mL)=ΔA×V反总×109ε×d×V样本×TNAD-ME活性(U/mL)=ε×d×V样本×TΔA×V反总×109
ΔA：1min内吸光度变化值
V反总：反应体系总体积（1.65mL）
ε：NADH摩尔消光系数（6.22×10³ L/(mol·cm)）
d：比色皿光径（1cm）
V样本：测定时加入样本体积（0.05mL）
T：反应时间（1min）
简化公式
血清/血浆样本：NAD-ME（U/mL）= 4275 × ΔA
组织样本（蛋白浓度）：NAD-ME（U/mgprot）= 4275 × ΔA ÷ Cpr
组织样本（鲜重）：NAD-ME（U/g鲜重）= 4275 × ΔA ÷ W
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免酶失活；-80℃可保存1个月
匀浆与超声破碎需在冰浴中进行，控制温度在0-4℃
避免样本接触金属离子，可用EDTA螯合
试剂使用：
试剂三需现配现用，-20℃分装保存可稳定1个月
不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线
试剂二溶解后4℃可保存一周，避免反复冻融
测定过程：
反应温度严格控制在37℃（最适温度）或25℃（其他物种）
若ΔA值大于0.5，需稀释样本后重新测定，提高检测灵敏度
若ΔA值小于0.005，可延长反应时间到2分钟或5分钟
质量控制：
每次实验设置空白对照（提取液替代样本）和阳性对照
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质、样本处理是否正确
实验前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验
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