商品属性
产品名称 | NAD苹果酸脱氢酶（NADMDH）测试盒 | 产品货号 | BH-96114 |
规格 | 100管/96样、50管/48样 | 产品分类 | 辅酶Ⅰ系列 |
测试方法 | 微量法、紫外分光光度法 | 用途 | 仅供科研实验 |
测定意义与原理
测定意义
MDH（EC1.1.1.37）广泛存在于各类生物细胞中，分为NAD依赖型和NADP依赖型：
线粒体NAD-MDH是三羧酸循环关键酶，催化苹果酸生成草酰乙酸，为能量代谢提供核心中间产物
胞质NAD-MDH参与苹果酸-天冬氨酸穿梭系统，调控胞质NADH进入线粒体氧化，对维持细胞能量稳态至关重要
酶活性变化可反映细胞能量代谢状态、活性氧水平及动植物抗病性
测定原理
NAD-MDH催化NADH还原草酰乙酸生成苹果酸，导致340nm处光吸收下降，通过监测吸光度下降速率计算酶活性。
自备仪器与试剂
仪器：紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、恒温水浴锅、可调式移液器、超声破碎仪（细菌/细胞样本）
耗材：1mL石英比色皿/96孔板、研钵/组织匀浆器、离心管、一次性吸头
试剂：蒸馏水
样本前处理方法
细菌/细胞样本
收集细菌或细胞至离心管，离心弃上清
按500万细菌/细胞加入1mL提取液的比例混合
冰浴超声破碎（功率20%/200W，超声3s，间隔10s，重复30次）
8000g 4℃离心10min，取上清置冰上待测
组织样本
称取约0.05-0.1g组织，按1:5-10比例加入提取液
冰浴匀浆处理
8000g 4℃离心10min，取上清置冰上待测
血清（浆）样本
直接取上清液检测，无需前处理
测定操作步骤
紫外分光光度法操作
分光光度计预热30min，调节波长至340nm，蒸馏水调零
试剂一37℃预热15min，按下表加样： | 试剂名称 | 测定管（μL） | 空白管（μL） |
| 试剂二 | 10 | 10 |
| 试剂三 | 10 | 10 |
| 样本/蒸馏水 | 20 | 20 |
充分混匀后立即记录340nm处初始吸光度A₁和反应1min后的吸光度A₂
计算ΔA = A₁ - A₂，分别记录测定管和空白管的ΔA值
酶活力计算方法
血清（浆）样本
单位定义：每mL血清（浆）每分钟消耗1nmol NADH为1个活力单位
NAD-MDH (U/mL) = 6430 × (ΔA测定 - ΔA空白)
组织样本（按蛋白浓度计算）
单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH为1个活力单位
NAD-MDH (U/mgprot) = 6430 × (ΔA测定 - ΔA空白) ÷ Cpr
Cpr：样本蛋白质浓度（mg/mL）
组织样本（按鲜重计算）
单位定义：每g组织每分钟消耗1nmol NADH为1个活力单位
NAD-MDH (U/g鲜重) = 6430 × (ΔA测定 - ΔA空白) ÷ W
W：样本质量（g）
细菌/细胞样本
单位定义：每1万个细菌/细胞每分钟消耗1nmol NADH为1个活力单位
NAD-MDH (U/10⁴cell) = 13 × (ΔA测定 - ΔA空白)
注意事项
正式测定前建议选取2-3个预期差异大的样本做预实验
所有操作尽量在冰浴中进行，避免酶失活
若ΔA值大于0.5，建议将样本稀释后重新测定
试剂应按标签说明储存，不同批号试剂禁止混用
操作过程中使用一次性吸头，避免交叉污染
若初始吸光度小于0.7，建议增加样本量或减少稀释倍数
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