磷酸果糖激酶（PFK）/6磷酸果糖激酶/果糖6磷酸激酶测试盒
测定意义与原理
测定意义
PFK（EC2.7.1.11）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是糖酵解途径的关键调节酶，其活性检测具有重要意义：临床诊断：诊断和监测糖尿病、心血管疾病、神经系统疾病等代谢疾病疾病监测：评估细胞能量代谢状态、组织损伤程度和治疗效果生物学研究：了解糖酵解途径、细胞凋亡和细胞增殖机制药物研发：筛选糖酵解途径抑制剂，用于治疗癌症和代谢疾病
测定原理
PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PFK活性。反应式如下： 果糖-6-磷酸+ATP→PFK果糖-1,6-二磷酸+ADP果糖-6-磷酸+ATPPFK果糖-1,6-二磷酸+ADP 丙酮酸+NADH+H+→乳酸脱氢酶乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+乳酸脱氢酶乳酸+NAD+
试剂盒组成
组分 规格 作用说明
提取液 液体60mL×1瓶 含提取液，用于提取样本中的PFK
试剂一 液体47.5mL×1瓶 含反应缓冲液，用于提供适宜的反应pH环境
试剂二 粉剂×1瓶 含底物液，反应底物
试剂三 粉剂×1瓶 含辅助底物，反应辅助因子
标准品 1mL×1支 含PFK标准液，用于建立标准曲线
自备仪器与试剂
必备仪器
分光光度法/微量法/比色法：紫外分光光度计/酶标仪/可见分光光度计、1mL石英比色皿/96孔板/1mL玻璃比色皿、台式离心机、恒温水浴锅、可调式移液器、研钵、电子天平
荧光法：荧光分光光度计、微量石英比色皿、台式离心机、恒温水浴锅、可调式移液器、研钵、电子天平
必备耗材
离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器、超声破碎仪
自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水
样本前处理方法
细菌或培养细胞样本收集：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清破碎：按照细菌或细胞数量（10⁴个）:提取液体积(mL)为500~1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测
组织样本取样：按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测
血清/血浆样本
血清(浆)样品：直接检测
测定操作步骤
仪器预热：分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到340nm，蒸馏水调零试剂配制：
工作液：将试剂二全部倒入试剂一瓶中，37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）预热10分钟
试剂三稀释：500μL试剂三加500μL蒸馏水，混匀后-20℃保存备用样本测定：
试剂名称(μL) 空白管 测定管
蒸馏水/样本 100 100
工作液 800 800
试剂三 100 100
混匀后立即记录340nm处反应5min时的吸光值A1和10min时的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2
结果计算方法
单位定义
U/mg prot：每毫克组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH的酶量
U/g 鲜重：每克组织每分钟消耗1nmol NADH的酶量
U/L：每升样本每分钟消耗1nmol NADH的酶量
计算公式
PFK活性(U/mg prot)=ΔA×V总ε×d×Cpr×T×V样×109PFK活性(U/mg prot)=ε×d×Cpr×T×V样ΔA×V总×109
ΔA：样本管吸光度变化值
V总：反应体系总体积（L）
ε：NADH摩尔消光系数（6.22×10³ L/mol/cm）
d：比色皿光径（cm）
Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）
T：反应时间（min）
V样：样本体积（L）
性能指标
指标 分光光度法/微量法/比色法/荧光法
线性范围 0~50U/L
最低检测限 ≤0.1U/L
回收率 90%~110%
批内精密度 CV≤1.7%
批间精密度 CV≤5.0%
稳定性 2-8℃保存6-12个月
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免PFK失活；-20℃可保存3个月
组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活
液体样本需避免溶血和细菌污染
试剂使用：
试剂需临用前配制，避免氧化失效
不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线
标准品需4℃保存，避免反复冻融
测定过程：
反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）
加入样品启动反应后3秒内即刻比色测定
若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定
质量控制：
每次实验需设置空白对照和质控样本
定期校准仪器，确保检测结果准确性
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确
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