病猪蓝耳高致病/NADC-30株（PRRSV-M/PRRSV-NADC30）核酸检测试剂盒（双重荧光PCR法）

产品介绍：

病猪蓝耳高致病/NADC-30株（PRRSV-M/PRRSV-NADC30）核酸检测试剂盒（双重荧光PCR法）是一种专门用于兽医临床诊断的分子生物学工具。该试剂盒能够在一个反应体系中同时检测并区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV，俗称高致病性蓝耳病病毒）和NADC-30-like株（一种目前在我国广泛流行且易发生重组的毒株）。

这两种毒株均能引起猪群严重的呼吸道疾病和繁殖障碍，且临床症状相似，易发生混合感染。本试剂盒通过双重荧光PCR技术，实现了对这两种重要病原体的高效、精准鉴别诊断。

该试剂盒基于双重实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）技术，采用TaqMan探针法原理。由于病毒的遗传物质是RNA，该检测首先将样本中的病毒RNA反转录为cDNA，再进行PCR扩增。

检测靶标：

高致病性猪蓝耳病毒 (PRRSV-M)：针对其特征性的Nsp2基因缺失变异区或ORF7基因设计特异性引物和探针。该毒株通常指以JXA1株为代表的高致病性变异株，能引起猪群高热、高死亡率。

NADC-30株 (PRRSV-NADC30)：针对其NSP2基因的5'-UTR重组断裂点或ORF5基因的特异性区域设计引物和探针。NADC-30-like株目前在我国猪场流行率高，常与高致病性毒株重组，导致致病性增强。

荧光标记与通道：

FAM通道：通常用于检测NADC-30株，探针标记FAM荧光基团。

HEX/VIC通道：通常用于检测高致病性株 (PRRSV-M)，探针标记HEX或VIC荧光基团。

部分试剂盒会设置内参基因（如猪GAPDH或β-actin基因，标记Cy5等通道），用于监控样本质量及排除PCR抑制物导致的假阴性。

核心优势：

双重检测，高效鉴别：一次实验即可同时检出两种流行毒株，有效区分单一感染与混合感染，为临床精准用药和疫苗选择提供依据。

高特异性：引物和探针经过精心设计，能特异性识别目标毒株，与猪圆环病毒（PCV）、伪狂犬病毒（PRV）等其他猪源常见病原无交叉反应。

高灵敏度：检测灵敏度极高，最低检出限可达到 1×10³ copies/mL，能够有效检出样本中微量的病毒核酸。

快速便捷：采用一步法RT-qPCR，操作简便，全程检测时间约1-2小时。

市面上的试剂盒规格通常为 50次/盒 (50T)，

规格与成分

市面上的试剂盒规格通常为 50次/盒 (50T)，

一个完整的试剂盒通常包含以下组分：

组分名称  规格/描述  作用

qRT-PCR预混液 (Master Mix)  含逆转录酶、Taq酶、dNTPs、缓冲液  提供RT-PCR反应所需的核心酶和底物

双重引物/探针混合物  含FAM标记的NADC-30探针 + HEX标记的PRRSV-M探针  特异性识别并扩增目标病毒序列

阳性对照 (Positive Control)  含NADC-30和PRRSV-M目标基因片段的质粒混合物  用于验证试剂盒的有效性

阴性对照 (Negative Control)  无核酸酶水  用于监控反应体系是否存在污染

使用方法

标准操作流程遵循分子生物学实验规范：

样本采集与处理：

采集样本：采集病猪的肺脏、脾脏、淋巴结等组织，或血清、全血样本。

处理方法：组织样本需进行匀浆处理，全血或血清样本可直接提取RNA。

RNA提取：

使用商业化的病毒RNA提取试剂盒（如磁珠法或离心柱法）提取样本中的总RNA。

反应体系配置：

按说明书比例混合预混液、引物探针混合液。

分装至PCR反应管，每管加入提取的RNA模板（通常为5-10μL）。

上机扩增：

仪器设置：在ABI 7500、Roche LightCycler 480等荧光定量PCR仪上运行。

反应程序（参考）：

逆转录：42-50℃ 10-30分钟

预变性：95℃ 3-10分钟

循环阶段（40-45个循环）：95℃ 15秒 → 55-60℃ 30-60秒（采集荧光）

结果判读：

PRRSV-M阳性：HEX/VIC通道出现典型的“S”型扩增曲线，且Ct值 ≤ 阈值（如35-40）。

PRRSV-NADC30阳性：FAM通道出现典型的“S”型扩增曲线，且Ct值 ≤ 阈值。

双重阳性：FAM和HEX两个通道均出现阳性扩增曲线。

阴性：两个通道均无扩增曲线或Ct值为“Undet”（未检测到）。

注意事项

保存条件：试剂盒需在 -20℃避光 条件下保存，有效期通常为12个月。避免反复冻融，尤其是酶制剂和阳性对照。

适用范围：该产品仅供兽医诊断、科研或工业检测使用，不可用于临床医疗。

生物安全：猪繁殖与呼吸综合征病毒属于动物病原微生物，处理阳性样本时需在生物安全二级（BSL-2）实验室进行，穿戴防护装备，防止气溶胶感染。

防污染：PCR实验极易受污染，必须严格分区操作（试剂准备区、样本处理区、扩增区），使用带滤芯的枪头，防止扩增产物污染导致假阳性。

方法优势

相较于传统的细菌培养法（耗时长、生物安全要求极高）或血清学检测（窗口期长），荧光PCR法具有显著优势：

高特异性： 通过针对鼠疫杆菌特异性基因（如caf1、pla）设计的引物和探针，能够精准识别目标菌，有效区分近缘菌种（如假结核耶尔森氏菌），避免假阳性。

高灵敏度： 检测灵敏度极高（部分产品最低检测限可达1-10 CFU/mL或10-100拷贝/毫升），有助于在感染早期、菌血症含量较低或样本经过抗生素治疗后做出准确判断。

快速高效： 从样本DNA提取到出结果通常在数小时内完成，远快于传统培养法（通常需要数天），适合在突发公共卫生事件中对大量样本进行快速筛查。

安全便捷： 采用闭管检测模式，扩增后无需开盖处理，大大降低了扩增产物污染和操作人员接触高致病性病原体的风险。部分试剂盒采用预混冻干技术，便于试剂的储存和运输。

公司正在出售的产品：

质量控制与常见问题：

污染防控：

分区操作（试剂准备区、样本处理区、扩增区），使用带滤芯吸头。

实验后用10%次氯酸或紫外灯清洁工作台。

假阴性处理：

检查样本抑制物（如使用内标基因）。

试剂保存：

-20℃避光保存，避免反复冻融。