结合态淀粉合成酶(GBSS）测试盒
测定意义与原理
测定意义
结合态淀粉合成酶（GBSS, EC2.4.1.21）以束缚态存在于淀粉体中，催化淀粉链的加长反应，主要负责直链淀粉的合成。其活性检测具有重要意义：农业研究：研究作物淀粉品质改良、抗逆性机制和肥料效应食品工业：评估食品营养价值、控制食品加工过程和质量生物学研究：了解植物能量代谢途径和碳代谢调控机制基础研究：研究淀粉合成相关基因功能和表达调控
测定原理
GBSS催化ADPG与淀粉引物（葡聚糖）反应，将葡萄糖分子转移到淀粉引物上，同时生成ADP；进一步通过反应体系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化NADP+还原为NADPH，其中NADPH生成量与前一步反应生成的ADP数量呈正比，通过340nm下测定NADPH的增加量，可以计算GBSS活性。反应式如下： ADPG+淀粉引物→GBSS加长的淀粉链+ADPADPG+淀粉引物GBSS加长的淀粉链+ADP ADP+PEP→丙酮酸激酶ATP+丙酮酸ADP+PEP丙酮酸激酶ATP+丙酮酸 ATP+葡萄糖→己糖激酶6-磷酸葡萄糖+ADPATP+葡萄糖己糖激酶6-磷酸葡萄糖+ADP 6-磷酸葡萄糖+NADP+→6-磷酸葡萄糖脱氢酶6-磷酸葡萄糖酸+NADPH+H+6-磷酸葡萄糖+NADP+6-磷酸葡萄糖脱氢酶6-磷酸葡萄糖酸+NADPH+H+
试剂盒组成
组分 规格 作用说明
提取液 液体100mL×2瓶 用于提取样本中的GBSS
试剂一 液体40mL×1瓶 含缓冲液和底物ADPG溶液
试剂二 粉剂×1瓶 含丙酮酸激酶和己糖激酶溶液
试剂三 粉剂×1瓶 含6-磷酸葡萄糖脱氢酶溶液
试剂四 粉剂×1瓶 含NADP+溶液
试剂五 粉剂×1支 含葡萄糖溶液
试剂六 粉剂×1支 含PEP溶液
自备仪器与试剂
必备仪器
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、恒温水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿/96孔板、研钵、电子天平
必备耗材
离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器、超声破碎仪
自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水
样本前处理方法
植物组织样本取样：称取0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴中匀浆离心：10000g，4℃离心10min，弃上清重悬：在沉淀中加入1mL提取液充分混匀，置冰上待测
血清/血浆样本采集：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20°C，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻处理：直接检测。
细胞/微生物样本收集：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清破碎：按照细菌或细胞数量（10⁴个）:提取液体积(mL)为500~1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测
测定操作步骤
仪器预热：紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到340nm，蒸馏水调零试剂配制：
试剂二工作液：临用前取1瓶试剂二加入8mL试剂一，缓慢加热，逐渐升温至煮沸使其溶解，冷却后加入1支试剂二B和1支试剂二C混合溶解备用
试剂三工作液：临用前取1瓶试剂三B加入5mL试剂三A溶解备用
试剂五工作液：临用前取1瓶试剂五B加入8mL试剂五A和1支试剂五C溶解备用
试剂六工作液：临用前取1支加入208μL蒸馏水充分溶解备用
试剂七工作液：临用前加入2mL蒸馏水溶解备用样本测定：
试剂名称(μL) 空白管 测定管
蒸馏水/样本 10 10
试剂二工作液 100 100
试剂三工作液 100 100
试剂四工作液 50 50
试剂五工作液 20 20
试剂六工作液 10 10
试剂七工作液 10 10
混匀后立即记录340nm处初始吸光值A1和2min后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1标准曲线绘制：将GBSS标准品稀释成0、10、20、30、40、50U/L系列浓度，同样处理，测定2min内吸光度变化，绘制标准曲线
结果计算方法
单位定义
U/g：每克样本每分钟催化生成1μmol ADP的酶量
U/mg prot：每毫克组织蛋白每分钟催化生成1μmol ADP的酶量
U/10⁴ cell：每1万个细胞每分钟催化生成1μmol ADP的酶量
计算公式
GBSS活性(U/g)=ΔA×V总ε×d×T×W×106GBSS活性(U/g)=ε×d×T×WΔA×V总×106
ΔA：样本管吸光度变化值
V总：反应体系总体积（L）
ε：NADPH摩尔消光系数（6.22×10³ L/mol/cm）
d：比色皿光径（cm）
T：反应时间（min）
W：样本质量（g）
性能指标
指标 详情
线性范围 0~50U/g
最低检测限 ≤0.1U/g
回收率 90%~110%
批内精密度 CV≤2.2%
批间精密度 CV≤5.0%
稳定性 未开封产品6-12个月；已开封试剂需在6个月内用完；工作液需现配现用
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免GBSS失活；-20℃可保存3个月
组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活
超声波破碎时需控制功率和时间，避免样本降解
试剂使用：
试剂需临用前配制，避免氧化失效
不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线
标准品需4℃保存，避免反复冻融
测定过程：
反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）
加入样品启动反应后3秒内即刻比色测定
若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定
质量控制：
每次实验需设置空白对照和质控样本
定期校准仪器，确保检测结果准确性
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确
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