商品属性
产品名称 | 类黄酮糖基转移酶(UFGT）测试盒 | 产品货号 | BH-961184 |
规格 | 100管/96样、50管/48样 | 产品分类 | 氧化与抗氧化系列 |
测试方法 | 微量法、紫外分光光度法 | 用途 | 仅供科研实验 |
测定意义与原理
测定意义
类黄酮糖基转移酶（UFGT）是植物类黄酮生物合成途径的关键酶，具有重要的生理功能和应用价值：植物呈色调控：催化不稳定花色素转化为稳定花色苷，决定植物花色、果色等色泽抗氧化活性：提高类黄酮的水溶性和稳定性，增强植物抗氧化能力抗逆性增强：参与植物对干旱、低温、病虫害等逆境胁迫的响应果实品质：影响果实色泽、风味、营养价值和货架期植物育种：作为选育高花色苷含量品种的重要指标
测定原理
采用偶联酶法，UFGT催化UDP-葡萄糖与槲皮素生成UDP，UDP在丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶作用下氧化NADH为NAD+，NAD+生成速度与UDP含量成正比，通过340nm吸光度下降速度反映UFGT活性。反应式如下： UDP-葡萄糖+槲皮素→UFGT槲皮素糖苷+UDPUDP-葡萄糖+槲皮素UFGT槲皮素糖苷+UDP UDP+磷酸烯醇式丙酮酸→丙酮酸激酶UTP+丙酮酸UDP+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶UTP+丙酮酸 丙酮酸+NADH+H+→乳酸脱氢酶乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+乳酸脱氢酶乳酸+NAD+
试剂盒组成
组分 规格 作用说明
试剂一 液体60mL×1瓶 含0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl缓冲液，提供酶促反应环境
试剂二 粉剂×1瓶 含槲皮素底物，需临用前加入20mL蒸馏水溶解
试剂三 粉剂×1瓶 含UDP-葡萄糖，需临用前加入10mL蒸馏水溶解
试剂四 液体20mL×1瓶 含偶联酶混合液，需临用前加入10mL蒸馏水溶解
提取液 液体30mL×1瓶 含缓冲液，用于植物样本提取
标准品 液体1mL×1支 含0.1U/mL UFGT标准品，用于校准和验证
自备仪器与试剂
必备仪器
紫外分光光度计/酶标仪（340nm检测通道）
低温离心机（≥12000g）
恒温水浴锅/金属浴（控温精度±0.5℃）
可调式移液器（10-1000μL）
组织匀浆器/研钵
超声波破碎仪
必备耗材
离心管（1.5mL、10mL）、一次性吸头、手术剪/镊子
自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水
样本前处理方法
植物组织样本取新鲜植物组织约0.1g，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分加入1mL提取液，冰浴匀浆12000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测若酶活性过高，用提取液稀释1-10倍后测定
细胞样本收集500万对数生长期细胞，8000g 4℃离心5min弃上清加入1mL提取液，冰浴超声波破碎（功率20%或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次）12000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测
果实样本取新鲜果实约0.5g，去皮去核，加入1mL提取液冰浴匀浆12000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测若酶活性过高，用提取液稀释1-10倍后测定
测定操作步骤
试剂配制工作液配制：取试剂一20mL + 试剂二0.2mL + 试剂三0.2mL + 试剂四0.5mL，混匀（现配现用）标准品稀释：将0.1U/mL UFGT标准品用提取液稀释成0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1U/mL系列浓度
标准曲线建立取比色管，加入标准品溶液0.2mL + 工作液0.8mL，立即混匀340nm波长下测定初始吸光值A1和10min后的吸光值A2，计算ΔA = A1 - A2以UFGT浓度为横坐标，ΔA为纵坐标，绘制标准曲线
样本测定反应体系：取样本0.2mL + 工作液0.8mL，立即混匀吸光度测定：340nm波长下测定初始吸光值A1和10min后的吸光值A2，计算ΔA = A1 - A2空白对照：取提取液0.2mL + 工作液0.8mL，同样处理作为空白计算ΔA：ΔA = (A1-A2)样本 - (A1-A2)空白
ELISA法操作取96孔板，加入标准品/样本50μL + HRP标记检测抗体100μL，37℃温育60min弃去液体，洗涤5次，每次300μL加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min加入终止液50μL，15min内在450nm波长下测定吸光度
结果计算方法
单位定义
U/mgprot：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol UDP的酶量
U/g鲜重：每g组织每分钟生成1nmol UDP的酶量
U/10⁴cell：每10⁴个细胞每分钟生成1nmol UDP的酶量
计算公式
UFGT酶活(U/mgprot)=ΔA×V反总ε×d×t×Cpr×V样×109UFGT酶活(U/mgprot)=ε×d×t×Cpr×V样ΔA×V反总×109
ΔA：340nm处吸光度变化值
V反总：反应体系总体积（L）
ε：NADH摩尔消光系数（6.22×10³ L/mol/cm）
d：比色皿光径（cm）
t：反应时间（min）
Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）
V样：样本加入体积（L）
ELISA法计算绘制标准曲线：以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标计算样本浓度：将样本吸光度代入标准曲线回归方程，计算UFGT浓度结果换算：UFGT活性（U/L）= 样本浓度（ng/mL）× 换算系数（根据试剂盒说明书）
性能指标
指标 要求
线性范围 0~0.1U/mL UFGT，线性相关系数r≥0.995
最低检测限 ≤0.005U/mL
回收率 90%~110%
批内精密度 CV≤5.0%
批间精密度 CV≤8.0%
稳定性 2-8℃保存12个月，活性保留≥90%
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免酶活性失活；-80℃可保存1个月
提取过程需在冰浴中进行，防止UFGT失活
样本处理需避免光照，防止槲皮素降解
试剂使用：
UDP-葡萄糖溶液需现配现用，或分装-20℃避光保存
底物溶液需临用前配制，避免分解
不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线
测定过程：
反应时间需严格控制，保持线性范围内的吸光度变化
测定需在37℃（哺乳动物）或25℃（植物）条件下进行
若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定
质量控制：
每次实验需设置空白对照和质控样本
定期校准仪器，确保检测结果准确性
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确
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