商品属性
产品名称 | 多胺氧化酶(PAO)测试盒 | 产品货号 | BH-961185 |
规格 | 100管/96样、50管/48样 | 产品分类 | 氧化与抗氧化系列 |
测试方法 | 微量法、可见分光光度法 | 用途 | 仅供科研实验 |
测定意义与原理
测定意义
多胺氧化酶（PAO）是催化生物体内多胺氧化的关键酶，具有重要的生理功能和应用价值：植物生理学：参与植物对逆境胁迫的反应和生长发育过程人类医学：与心血管疾病、神经系统疾病、肿瘤等密切相关动物医学：可作为动物健康状况的生物标志物食品安全：检测食品中多胺含量，评估食品新鲜度和质量
测定原理
PAO催化多胺氧化产生过氧化氢，在过氧化物酶存在的条件下，过氧化氢与4-氨基安替比林和苯酚反应生成红色醌类化合物，在510nm处有特征吸收峰，吸光度增加速率与PAO活性成正比。反应式如下： 多胺+O2+H2O→PAO醛+H2O2多胺+O2+H2OPAO醛+H2O2 H2O2+4−氨基安替比林+苯酚→POD红色醌类化合物H2O2+4−氨基安替比林+苯酚POD红色醌类化合物
试剂盒组成
组分 规格 作用说明
试剂A 液体100mL×1瓶 含0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl缓冲液，提供酶促反应环境
试剂B 液体10mL×1瓶 含4-氨基安替比林和苯酚混合液，显色反应试剂
试剂C 液体10mL×1瓶 含过氧化物酶（POD），催化剂
试剂D 液体5mL×1瓶 含10mmol/L亚精胺溶液，酶促反应底物
标准品 液体1mL×1支 含100U/L PAO标准品，用于建立标准曲线
自备仪器与试剂
必备仪器
分光光度法：可见分光光度计（510nm检测通道）、1mL玻璃比色皿
微量法：酶标仪（510nm检测通道）、96孔板
ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板
通用：低温离心机（≥8000g）、恒温水浴锅、可调式移液器、研钵/组织匀浆器
必备耗材
离心管（1.5mL、10mL）、一次性吸头、手术剪/镊子
自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水
样本前处理方法
植物组织样本取新鲜植物组织，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分称取约0.1g组织，加入1mL提取液（试剂A），冰浴匀浆8000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测若酶活性过高，用提取液稀释1-10倍后测定
动物组织样本取动物组织，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分称取约0.1g组织，加入1mL提取液，冰浴匀浆8000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测样本可-20℃保存3个月，避免反复冻融
血清/血浆样本血清样本：室温血液自然凝固10-20分钟后，2000-3000r/min离心20分钟左右，收集上清血浆样本：用肝素/柠檬酸钠抗凝，5000g 4℃离心10min，取上清直接测定样本避免溶血，溶血会导致结果偏高
细胞培养液样本取细胞培养液，8000g 4℃离心10min，取上清液直接测定若酶活性过高，用提取液稀释1-10倍后测定样本可-20℃保存3个月，避免反复冻融
测定操作步骤
分光光度法操作仪器预热：分光光度计预热30min以上，调节波长至510nm，蒸馏水调零工作液配制：取试剂A 8.5mL + 试剂B 0.5mL + 试剂C 0.5mL + 试剂D 0.5mL，混匀即为工作液样本测定：
取1mL玻璃比色皿，加入0.1mL样本上清液和0.9mL工作液，立即混匀
记录初始吸光值A1，37℃恒温孵育30min后记录吸光值A2，计算ΔA = A2 - A1
空白对照：取0.1mL提取液替代样本上清液，同样处理标准曲线：将标准品用提取液稀释成0、20、40、60、80、100U/L系列浓度，同样处理
ELISA法操作样本处理：将样本稀释至合适浓度（5-160U/mL）加样：取96孔板，加入标准品/样本50μL + HRP标记检测抗体100μL，37℃温育60min洗涤：弃去液体，洗涤5次，每次300μL显色：加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：加入终止液50μL，15min内在450nm波长下测定吸光度
结果计算方法
单位定义
U/g 鲜重：每克组织每分钟催化产生1μmol过氧化氢的酶量
U/L：每毫升血清/血浆每分钟催化产生1μmol过氧化氢的酶量
U/mgprot：每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol过氧化氢的酶量
计算公式
PAO酶活性(U/g鲜重)=(A样−A空)×C标×V总(A标−A空标)×t×WPAO酶活性(U/g鲜重)=(A标−A空标)×t×W(A样−A空)×C标×V总
A样-A空：样本扣除空白后的吸光度变化值
C标：标准品浓度（U/L）
V总：样本提取液总体积（mL）
A标-A空标：标准品扣除空白后的吸光度变化值
t：反应时间（min）
W：样本质量（g）
ELISA法计算绘制标准曲线：以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标计算样本浓度：将样本吸光度代入标准曲线回归方程，计算PAO浓度结果换算：PAO活性（U/L）= 样本浓度（ng/mL）× 换算系数（根据试剂盒说明书）
性能指标
指标 要求
线性范围 0~100U/L，线性相关系数r≥0.995
最低检测限 ≤1U/L
回收率 90%~110%
批内精密度 CV≤5.0%
批间精密度 CV≤8.0%
稳定性 2-8℃保存12个月，活性保留≥90%
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免酶活性失活；-20℃可保存3个月
提取液需用pH7.5 Tris-HCl缓冲液，避免过酸或过碱影响酶活性
样本处理过程中需避免高温和光照，防止酶活性降低
试剂使用：
工作液需现配现用，4℃保存不超过3天
底物溶液需临用前配制，避免分解
不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线
测定过程：
反应温度需严格控制在37℃，反应时间30min
需立即记录初始吸光度值，避免底物自发转化
若吸光度增加超过50%，需稀释样本后重新测定
质量控制：
每次实验需设置空白对照和质控样本
定期校准仪器，确保检测结果准确性
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确
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