吡咯啉5羧酸合成酶（P5CS）测试盒

商品属性

测定意义与原理

测定意义

吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是植物体内以谷氨酸为前体合成脯氨酸途径的关键酶，对植物适应逆境胁迫起关键作用，其测定具有重要的生理和科研价值：植物生理研究：探究植物抗逆机制，如抗旱、抗盐、抗寒等农业应用：筛选抗逆性强的作物品种，提高作物产量环境监测：评估土壤和水体污染对植物生理的影响生物学研究：了解氨基酸代谢途径和植物生长发育机制

测定原理

分光光度法（钼酸铵比色法）

P5CS催化谷氨酸生成P5C过程中分解ATP生成ADP和无机磷，通过钼酸铵比色法测定单位时间内产生无机磷的量可确定P5CS活性。反应式如下： ATP+谷氨酸→P5CSADP+无机磷+P5CATP+谷氨酸P5CSADP+无机磷+P5C 无机磷+钼酸铵→磷钼酸铵复合物无机磷+钼酸铵→磷钼酸铵复合物 在660nm波长下测定吸光度，其吸光度与P5CS活性成正比。

ELISA法

采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验：预先包被植物吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）捕获抗体的包被微孔中加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体经过温育并彻底洗涤，用底物TMB显色TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色颜色深浅与样品中的植物吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）呈正相关，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)计算样品浓度

试剂盒组成

分光光度法/微量法试剂盒

组分 规格 作用说明

试剂一 液体60mL×1瓶 含提取缓冲液，用于提取样本中的P5CS

试剂二 液体6mL×1瓶 含谷氨酸底物溶液

试剂三 液体6mL×1瓶 含ATP溶液，酶反应底物

试剂四 粉剂×1瓶 含钼酸铵溶液，用于检测反应生成的无机磷

试剂五 粉剂×1瓶 含抗坏血酸溶液，还原剂，用于还原磷钼酸铵

试剂六 液体25mL×1瓶 含硫酸溶液，酸性显色条件

试剂七 液体10mL×1瓶 含10mmol/L标准磷贮备液，用于建立标准曲线

ELISA法试剂盒

组分 规格 作用说明

酶标包被板 12孔×8条 预先包被植物吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）捕获抗体

酶标试剂 液体6mL×1瓶 含HRP标记的检测抗体，用于检测植物吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）

标准品 0.3mL×6管 含植物吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）标准品（0、2.5、5、10、20、40、80U/L）

样本稀释液 10mL×1瓶 用于稀释样本和标准品

显色剂A液 6mL×1瓶 含过氧化氢溶液

显色剂B液 6mL×1瓶 含TMB溶液

终止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液

20倍浓缩洗涤液 20mL×1瓶 用于洗涤酶标板

自备仪器与试剂

必备仪器

分光光度法/微量法：可见外分光光度计（660nm检测通道）、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵

ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板、37℃恒温箱、洗板机

通用：电子天平（精度0.01g）、研钵/组织匀浆器、恒温水浴锅、可调式移液器、冰和蒸馏水

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、三氯乙酸

样本前处理方法

动植物组织样本取样：称取0.1-0.5g新鲜组织，用蒸馏水洗净表面杂质，用滤纸吸干匀浆：按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例，进行冰浴匀浆离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测稀释：若P5CS活性过高，用试剂一稀释1-10倍后测定

血清/血浆样本采集：空腹采集静脉血，分离血清/血浆保存：4℃可保存3天，-20℃可保存1个月检测：直接检测或稀释后测定

细胞样本收集：收集1×10⁶细胞，3000g离心10min去除细胞碎片破碎：加入1mL试剂一，冰浴超声波破碎（功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

土壤样本取样：取新鲜土壤样品，风干后过2mm筛提取：称取1g土壤，加入5mL试剂一，振荡提取30min过滤：用滤纸过滤，取滤液备用保存：若不立即测定，滤液需置于4℃冷藏保存

测定操作步骤

分光光度法操作试剂配制：

试剂四用时加入25mL蒸馏水，溶解后4℃保存一周

试剂五用时加入25mL蒸馏水，溶解后4℃保存一周

0.5μmol/mL标准磷应用液配制：将试剂七20倍稀释，即取0.1mL试剂七加1.9mL蒸馏水充分混匀

定磷剂的配制：按H₂O:试剂四:试剂五:试剂六=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色，现用现配酶促反应：

在EP管中加入50μL样本、50μL试剂二和50μL试剂三，混匀

37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）准确水浴10min

加入50μL试剂三，混匀，8000g，25℃离心10min，取上清液定磷：

在EP管或96孔板中加入100μL上清液、100μL蒸馏水和200μL定磷剂，混匀

37℃水浴10min，取出冷却至室温，测定660nm波长下的吸光度空白对照：以蒸馏水代替样本，同样处理标准曲线绘制：将标准品稀释成0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μmol/mL系列浓度，同样处理

ELISA法操作试剂准备：

将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用

标准品按说明书稀释成0、2.5、5、10、20、40、80U/L系列浓度加样：

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL

样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加温育：

除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔

37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：

弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：

每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：

每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值

结果计算方法

单位定义

U/L：每升样本每小时催化生成1μmol无机磷的酶量

U/g 鲜重：每克鲜重样本每小时催化生成1μmol无机磷的酶量

ng/mL：每毫升样本中P5CS的浓度（ELISA法）

分光光度法计算公式

P5CS活性(U/L)=(A测定−A空白)×C标×V总(A标准−A空白)×V样×t×1000P5CS活性(U/L)=(A标准−A空白)×V样×t×1000(A测定−A空白)×C标×V总

A测定：样本管吸光度值

A空白：空白管吸光度值

A标准：标准管吸光度值

C标：标准品浓度（U/L）

V总：样本提取液总体积（mL）

V样：样本体积（mL）

t：反应时间（h）

ELISA法计算公式

P5CS含量(ng/mL)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数P5CS含量(ng/mL)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数

性能指标

指标 分光光度法/微量法 ELISA法

线性范围 0~0.5μmol/mL 2.5U/L–80U/L

最低检测限 ≤0.01μmol/mL ≤0.1U/L

回收率 90%~110% 90%~110%

批内精密度 CV≤5.0% CV≤10%

批间精密度 CV≤8.0% CV≤15%

稳定性 2-8℃保存12个月 2-8℃保存6个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免P5CS失活；-20℃可保存3个月

组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活

血清样本避免溶血，溶血会导致结果偏高

试剂使用：

粉剂试剂需现用现配，溶解后4℃保存一周

定磷剂需现用现配，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

分光光度法反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）

ELISA法需严格控制温育时间和温度，避免影响显色反应

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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