迟钝爱德华菌染料法荧光定量PCR试剂盒
商品属性
产品名称 | 迟钝爱德华菌染料法荧光定量PCR试剂盒 | 英文名称 | Edwardsiella tarda Dye-based qPCR Kit |
规格 | 50T | 货号 | PR4533 |
产品概述
迟钝爱德华菌是一种人-鱼共患的革兰氏阴性条件致病菌，广泛存在于水体环境中，可引发鱼类大量死亡及人类感染。本试剂盒以染料法荧光定量PCR技术为核心，基于该菌高度保守的基因序列设计引物，能实现对样本中迟钝爱德华菌核酸的快速定性与定量检测，适用于水产养殖病害监测、公共卫生病原筛查及相关科研工作。
产品特点
操作便捷：即开即用，用户仅需提供样本DNA模板，无需额外配制核心试剂
高特异性：引物针对迟钝爱德华菌保守区域设计，与其他近缘微生物无交叉反应
高灵敏度：检测下限可达100-1000拷贝/反应
宽线性范围：定量检测线性范围覆盖5个以上数量级
双重功能：可同时满足定性筛查与精确定量检测需求
污染防控：一管式封闭反应体系，有效避免产物污染
包装规格及成分
组分名称 规格 包装标识
2×qPCR MagicMix（含染料） 1mL 红盖管
超纯水 1mL 亮黄盖管
引物混合液 100μL 白盖管
阳性对照（1×10⁸拷贝/μL） 50μL 黄盖管
DNA抽提液（试用装） 9mL（15次用量） 透明管
使用手册 1份 -
运输与保存条件
运输：采用冰袋低温运输，避免冻融循环
保存：-20℃避光保存，有效期12个月
注意：阳性对照需单独存放，避免污染其他试剂；2×qPCR MagicMix避免反复冻融，频繁使用可分装后4℃短期存放（不超过1个月）
自备材料与仪器
材料：一次性无酶离心管、带滤芯吸头、一次性手套、口罩
仪器：荧光定量PCR仪、高速离心机、金属浴/PCR仪（用于核酸提取）、移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）
实验操作步骤
步骤1：阳性对照梯度稀释（用于定量检测）
标记6个离心管为2-7号
每管加入45μL荧光PCR专用模板稀释液
7号管加入5μL阳性对照，充分震荡1分钟，得到1×10⁷拷贝/μL的标准品
依次倍比稀释得到1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²拷贝/μL的系列标准品，全程换用新吸头，操作区与样本区严格分离
步骤2：样本DNA提取
可使用试剂盒配套的DNA抽提液或商业化核酸提取试剂盒，以下为配套抽提液操作方法：
液体培养物：取100μL培养物→8000rpm离心3min→弃上清→加50μL抽提液混匀→100℃加热10min→13000rpm离心3min→取5μL上清作为模板
固体菌落：挑取单菌落→加入50μL抽提液混匀→100℃加热10min→13000rpm离心3min→取5μL上清
粪便/组织样本：取适量样本→加0.5mL生理盐水混匀→13000rpm离心3min→弃上清→后续操作同液体培养物
环境水样：取2-3mL水样→13000rpm离心3min→弃上清→后续操作同液体培养物
步骤3：荧光定量PCR反应体系配制（20μL体系）
组分 样品管/阴性对照管 阳性对照管（标准品）
2×qPCR MagicMix 10μL 10μL
引物混合液 2μL 2μL
样本DNA/超纯水 8μL -
系列标准品/超纯水 - 8μL
⚠️ 注意：阴性对照用超纯水替代模板；先配制样品管与阴性对照，最后添加阳性对照，避免污染
步骤4：PCR反应程序设置
阶段 温度 时间 循环数
预变性 95℃ 5min 1
扩增循环 95℃ 10sec 40
60℃ 30sec（采集荧光）
⚠️ 注意：荧光信号采集通道选择FAM通道（染料最大发射波长530nm），可根据仪器型号微调退火温度
结果判读
定量检测
以阳性对照浓度的对数为横轴，Ct值为纵轴绘制标准曲线
根据样品Ct值从标准曲线计算对应核酸浓度
标准曲线R²值应≥0.99，否则需重新实验
定性检测
阴性对照Ct值≥40且无扩增曲线
阳性对照Ct值≤30且有典型S型扩增曲线
待测样品判读标准：
Ct值≤35：阳性
35<Ct值<40：重复实验，若仍<40则判为阳性
Ct值≥40：阴性
常见问题及解决方法
常见问题 可能原因 解决方法
所有样品均无扩增曲线 试剂失活/操作失误 检查试剂保存条件，重新配制反应体系
阳性对照正常，样品无扩增 模板降解/浓度过低 使用新鲜样本，优化模板加入量（5-15%体系）
非特异性扩增严重 退火温度过低/引物浓度高 提高退火温度，优化引物用量
阴性对照出现扩增曲线 交叉污染 更换无菌耗材，严格分区操作，加强实验室消毒
注意事项
本产品仅供科研使用，不得用于临床诊断
实验全程佩戴手套口罩，使用无菌耗材，避免交叉污染
反应体系配制需在冰上操作，避免试剂反复冻融
PCR仪可能需要优化反应程序，建议进行温度梯度预实验
样本采集后应尽快处理，-20℃保存不超过1个月，避免反复冻融
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