加A聚合酶（E.coli）

基本信息‌

‌英文名称‌：A-Tailing Polymerase (E.coli)
作用机制：E.coli DNA聚合酶I的Klenow片段，可在DNA分子的3'末端添加A尾；常用于TA克隆，将平末端DNA片段转化为粘性末端，便于与T载体连接；具有高效的加A活性与特异性。 

适用样本：平末端DNA片段的加A反应，适用于TA克隆、基因文库构建等实验。
产品概述
加A聚合酶（E.coli）即大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，具有5'→3'DNA聚合酶活性与3'→5'核酸外切酶校对活性，常被用于在DNA片段的3'末端添加单个腺苷酸（A）碱基。在PCR反应中，Taq DNA聚合酶通常会在PCR产物的3'末端添加一个突出的A碱基，而当使用高保真DNA聚合酶（如Pfu DNA聚合酶）进行PCR扩增时，产物为平末端。此时，可利用加A聚合酶（E.coli）在平末端DNA片段的3'末端添加A碱基，使其成为带有3'突出A的DNA片段，以便与带有3'突出T的T载体进行TA克隆。加A聚合酶（E.coli）催化的加A反应条件温和，通常在37℃条件下短时间内即可完成，为PCR产物的克隆提供了便捷的途径。此外，它还可用于DNA片段的末端填充、平末端化、DNA标记等其他分子生物学实验。
产品特点
加A效率高：高效催化平末端DNA片段的3'末端添加腺苷酸（A）碱基，适合TA克隆。

保真性好：具有3'→5'核酸外切酶校对活性，加A过程中错配率低。

反应条件简单：在37℃条件下短时间内即可完成加A反应，实验流程简便。

产物兼容性好：加A产物可直接与T载体连接，无需额外处理。

多功能性：还可用于DNA片段的末端填充、平末端化、DNA标记等其他实验。
实验前准备

试剂与耗材检查：确认PCR预混液、上下游引物、模板DNA、无酶水等试剂在有效期内，外观无浑浊、沉淀；PCR管、枪头需为无酶无菌规格。

仪器预热：提前10-15分钟启动PCR仪，设置好反应程序，确保仪器达到预设温度。

环境准备：在超净工作台内操作，佩戴无粉手套，避免交叉污染；操作前用75%酒精擦拭台面和移液器。

反应体系配制

冰上操作：将所有试剂放置于冰盒内，避免酶失活。

体系配比（以25μL体系为例）：

PCR预混液（含Taq酶、dNTP、Buffer）：12.5μL

上游引物（10μM）：1μL

下游引物（10μM）：1μL

模板DNA：1-5μL（根据模板浓度调整）

无酶水：补足至25μL

轻柔混匀：用移液器轻轻吹吸混合液3-5次，避免产生气泡；若有气泡可短暂离心去除。

分装体系：将配制好的反应液分装至PCR管中，每管25μL，盖紧管盖。

PCR仪上机反应

程序设置：根据引物Tm值和实验需求设置三步法或两步法程序：

预变性：95℃，3-5分钟

循环阶段：95℃变性30秒，55-65℃退火30秒，72℃延伸（根据片段长度调整，1kb约1分钟），循环25-35次

终延伸：72℃，5-10分钟

保温：4℃。

上机运行：将PCR管放入PCR仪样品槽，确保管盖紧密贴合；启动程序，等待反应完成。

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注意事项

无菌操作：所有试剂和耗材需高压灭菌或无菌处理，避免外源DNA污染

温度控制：酶、dNTP等试剂需-20℃储存，避免反复冻融

体系优化：根据引物Tm值、模板类型调整Mg²+浓度和退火温度

对照设置：每次实验需设置阴性对照（无模板）和阳性对照（已知阳性模板）