NADH氧化酶（NADH oxidase，NOX）试剂盒说明书
微量法 100管/96样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
NOX（EC 1.6.99.3）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可在氧气存在下，直接将NADH氧化为NAD。该酶不仅参与NAD的再生，而且与免疫反应密切相关。
测定原理：
NOX能够将NADH氧化为NAD，NADH的氧化与2,6二氯酚靛蓝（DCPIP）的还原相偶联，蓝色的DCPIP被还原为无色的DCPIP，在600nm下测定蓝色DCPIP的还原速率计算出NADH氧化酶活性的大小。
组成：
产品名称 | CE012-100T/96S | Storage |
试剂一：液体 | 100ml | -20℃ |
试剂二：液体 | 20ml | -20℃ |
试剂三：液体 | 1.5ml | -20℃ |
试剂四：液体 | 25ml | 4℃ |
试剂五：粉剂 | 1瓶 | -20℃ |
说明书 | 一份 |
试剂五：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入5ml蒸馏水，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
自备仪器和用品：
酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、96孔板、研钵、冰、蒸馏水
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
准确称取0.1g组织或收集500万细胞（OD=0.5的大肠杆菌溶液稀释100倍取1ml所获得的菌体数量约为500万个），加入1ml试剂一和10μl 试剂三，进行匀浆。
匀浆结束后，600xg、4℃离心5min。
弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11100xg、4℃离心10min。
上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的NOX（此步可选做）。
步骤④中的沉淀即为线粒体，加入200μl试剂二和2μl 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于NOX活性测定。
血清（浆）样品：800xg、4℃离心10min，吸取上清进行检测。
测定步骤：
酶标仪预热30min以上，调节波长至600nm，蒸馏水调零。
样本测定
（1）试剂四、试剂五于37℃（哺乳动物样品）或25℃（其它物种样品）预热5min。
（2）在2ml EP管中加入中加入10μl样本、200μl试剂四和40μl试剂五，混匀，吸取200μl至96孔板中使用动力学程序记录600nm处的初始吸光值A1和反应1min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。
NOX活力单位的计算
1、血清（浆）NOX活力的计算:
单位的定义：每ml血清（浆）在每ml反应体系中每分钟A600变化0.005定义为一个酶活力单位。
NOX（U/ml）＝ΔA×V反总÷V样÷0.01÷T=5000×ΔA
2、组织、细菌或细胞中NOX活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在每ml反应体系中每分钟A600变化0.005定义为一个酶活力单位。
NOX（U/mg prot）=ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.005÷T=5000×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织在每ml反应体系中每分钟A600变化0.005定义为一个酶活力单位。
NOX（U/g 鲜重）=ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.005÷T=1010×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞在每ml反应体系中每分钟A600变化0.005定义为一个酶活力单位。
NOX（U/104 cell）=ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.005÷T=2.02×ΔA
V反总：反应体系总体积，0.25ml； V样：加入样本体积，0.01ml；V样总：加入提取液体积，0.202 ml；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量；500：细胞或细菌总数，500万。
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