导读： 超广谱β-内酰胺酶（ESBL）是当今全球最严峻的细菌耐药问题之一，而CLSI表型确认试验是判定ESBL的金标准方法。ATCC 700603作为产SHV-18型ESBL的肺炎克雷伯菌标准菌株，是ESBL确认试验中不可或缺的必要质控菌。本文深入解析ESBL确认试验的原理、操作要点以及该菌株在其中的关键角色。
菌株基本信息
ATCC 700603的学名为 Klebsiella pneumoniae，携带blaSHV-18型ESBL基因。SHV-18属于Ambler A类ESBL，由SHV-1基因经多次点突变演化而来，可水解青霉素类、窄谱头孢菌素和三代头孢菌素（头孢噻肟、头孢他啶），以及氨曲南，但不能水解碳青霉烯类和头孢霉素类。
| 项目 | 内容 |
|------|------|
| 学名 | Klebsiella pneumoniae |
| ATCC编号 | 700603 |
| 生物安全等级 | BSL-2 |
| 推荐培养基 | MHA |
| 培养温度 | 35±2°C |
| 关键耐药基因 | blaSHV-18（ESBL） |
| ESBL表型确认试验 | 阳性（克拉维酸协同抑制） |
生物学特性与形态
ATCC 700603为革兰阴性短杆菌，在MHA上35°C培养18小时后，菌落较大、灰白色、黏液状（因荚膜多糖产生）。生化特征：氧化酶阴性、吲哚阴性、尿素酶阳性、枸橼酸盐阳性、赖氨酸脱羧酶阳性。
ESBL耐药机制
SHV-18型ESBL的活性中心包含一个丝氨酸残基，可通过酰化反应水解β-内酰胺环。与原始SHV-1酶相比，SHV-18在第238位和第240位氨基酸发生了关键突变（Gly→Ser和Glu→Lys），使其底物谱扩展至三代头孢菌素。
该酶可被克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦等丝氨酸型β-内酰胺酶抑制剂不可逆地抑制。这一特性正是ESBL表型确认试验（双纸片协同法/双纸片增效法）的机制基础。
培养条件与操作要点
操作规范与ATCC 25922基本一致。K-B法使用MHA，0.5号麦氏标准菌悬液密涂，贴含药纸片后35°C培养16-18小时。
ESBL筛选与确认试验操作
CLSI推荐的ESBL检测分为两步：
第一步：ESBL筛选
在MHA平板上贴头孢他啶(30μg)、头孢噻肟(30μg)、头孢曲松(30μg)、氨曲南(30μg)纸片。如果任一药物的抑菌圈直径低于以下阈值，提示可能产ESBL：
头孢他啶 ≤22mm
头孢噻肟 ≤27mm
头孢曲松 ≤25mm
氨曲南 ≤27mm
ATCC 700603作为产ESBL菌株，上述药物的抑菌圈均应低于筛选阈值。
第二步：ESBL表型确认（双纸片增效法）
在MHA平板上贴两组纸片：
两组纸片间距20-25mm。培养后测量抑菌圈直径：
ATCC 700603在确认试验中应表现为ESBL阳性（至少一组药物满足差值≥5mm的标准）。
在各标准中的应用
CLSI M100中的应用
ATCC 700603在CLSI M100中是ESBL表型确认试验的指定质控菌株。
ESBL确认试验质控预期结果：
| 纸片组合 | 预期结果 |
|----------|---------|
| 头孢他啶 vs 头孢他啶/克拉维酸 | 差值 ≥5mm（ESBL阳性） |
| 头孢噻肟 vs 头孢噻肟/克拉维酸 | 差值 ≥5mm（ESBL阳性） |
MIC法质控范围：
| 抗生素 | MIC范围 (μg/mL) |
|--------|----------------|
| 头孢他啶 | 8-32（ESBL水解） |
| 头孢他啶/克拉维酸 | 0.25/4-2/4（抑制剂保护） |
| 头孢噻肟 | 8-64（ESBL水解） |
| 头孢噻肟/克拉维酸 | 0.12/4-1/4（抑制剂保护） |
| 亚胺培南 | 0.06-0.5（碳青霉烯不受ESBL影响） |
ESBL分类体系中的定位
ESBL按Bush-Jacoby分类属于2be组，按Ambler分子分类属于A类。主要的ESBL家族包括：
TEM型（TEM-3至TEM-200+）：由TEM-1/TEM-2突变产生
SHV型（SHV-2至SHV-200+）：由SHV-1突变产生，ATCC 700603属于此家族
CTX-M型（CTX-M-1至CTX-M-200+）：目前全球最流行的ESBL型别，起源于克吕沃尔菌属
OXA型（D类）：部分具有ESBL活性
行业质控用途
ESBL确认试验质控： 这是ATCC 700603最核心的应用。实验室开展ESBL表型确认试验时，必须同时接种ATCC 700603（阳性对照）和大肠埃希菌ATCC 25922（阴性对照），以验证试验系统的鉴别能力。
ESBL筛查法验证： 自动化药敏系统的ESBL筛查模块在装机和定期验证时，ATCC 700603是标准阳性参考菌株。
耐药监测研究： 在细菌耐药监测项目（如CHINET、CARSS）中，ATCC 700603用于ESBL检测方法的标准化和质量控制。
菌种保藏与管理
管理规范同前述菌株。ESBL基因通常位于质粒上，高传代可能导致质粒丢失。传代次数控制在5代以内，每批新工作菌种应做一次ESBL确认试验验证表型。
安全注意事项
BSL-2级别。肺炎克雷伯菌是重要的院内感染病原体，可引起肺炎、尿路感染和血流感染。操作须在II级生物安全柜内进行。
常见问题与工程师建议
Q1：ESBL确认试验中头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸的差值刚好在5mm边界，如何判定？
严格按照CLSI标准：差值≥5mm判定为ESBL阳性。如果差值刚好等于5mm，判为阳性。如果差值为4mm，判为阴性，但建议用另一组药物（头孢噻肟/头孢噻肟+克拉维酸）重复确认。只要任一组满足≥5mm标准即判为ESBL阳性。
Q2：ATCC 700603产的是SHV-18，对CTX-M型ESBL检测的适用性如何？
SHV-18对头孢他啶的水解活性较强，但对头孢噻肟的水解活性可能不如CTX-M型酶。因此，ATCC 700603的头孢他啶差值通常较大，而头孢噻肟差值可能相对较小。如果需要验证CTX-M型ESBL的检测能力，建议补充使用产CTX-M型酶的质控菌株（如某些实验室使用的E. coli产CTX-M-15参考株）。
Q3：碳青霉烯酶（如KPC、NDM）与ESBL有什么区别？
ESBL属于A类丝氨酸酶，可被克拉维酸抑制，但不能水解碳青霉烯类和头孢霉素类。碳青霉烯酶（KPC属于A类、NDM属于B类金属酶、OXA-48属于D类）可水解碳青霉烯类药物。ATCC 700603不产碳青霉烯酶，对亚胺培南和美罗培南敏感。对于碳青霉烯酶的检测，需要使用其他专用质控菌株。
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