恶臭假单胞菌PCR检测试剂盒

本试剂盒特异性靶向恶臭假单胞菌保守基因序列，可精准检测样本中该致病菌核酸，专一性区分假单胞菌属其他菌种。试剂盒检测下限低、灵敏度优异，可检出低浓度致病菌样本，适配养殖环境、畜禽组织、分泌物等样本。主要用于畜禽恶臭假单胞菌感染病例诊断、养殖环境致病菌污染筛查、水质微生物安全检测及相关病原研究。

基础原理：

纯化待检样本细菌核酸，去除腐殖质等 PCR 抑制物。

引物靶向恶臭假单胞菌特异性代谢相关基因，种识别精准。

实时 PCR 扩增判读 Ct 值，完成该菌种核酸检测。

‌操作步骤‌：

（一）反应体系配制（冰上操作，防酶失活与污染）

按 “水→缓冲液→dNTP→引物→模板→Taq 酶” 顺序加样（酶最后加，避免失活）。

轻轻涡旋混匀，短暂离心（3000rpm，10s），使液体沉至管底。

无热盖的 PCR 仪：加 1 滴矿物油覆盖液面，防止蒸发。

（二）PCR 程序设置（标准 35 循环）

预变性：94℃，3-5min（彻底变性模板 DNA）。

循环阶段（35 次）：

变性：94℃，30s（双链解链）。

退火：55-65℃，30s（引物结合模板，按引物 Tm 值调整）。

延伸：72℃，1min/kb（Taq 酶合成新链，1kb 片段约 1min）。

终延伸：72℃，5-10min（确保片段完整延伸）。

保温：4℃，∞（防止非特异性复性，短期保存）。

（三）产物检测（琼脂糖凝胶电泳）

制胶：1% 琼脂糖凝胶（1g 琼脂糖 + 100mL 1×TAE 缓冲液），加热融化后加核酸染料，倒胶插梳，凝固 30min。

上样：取 5μL PCR 产物 + 1μL 上样缓冲液，点样；同时加 DNA Marker（分子量对照）。

电泳：120V，20-30min，至溴酚蓝迁移至凝胶 2/3 处。

成像：凝胶成像系统观察条带，目标片段位置与预期一致则为阳性。

四、参数优化

退火温度（Tm）：引物 Tm 值 = 4×(G+C)+2×(A+T)，退火温度一般低于 Tm 值 5℃，温度过高无条带，过低非特异性条带多。

Mg²⁺浓度：1.5-2.5mM，浓度过低酶活性低、产量少；过高非特异性扩增增加。

循环数：25-35 个循环，少于 25 个产物不足，多于 35 个易出现非特异性条带。

延伸时间：按目标片段长度调整，≤1kb 用 1min，1-3kb 用 2-3min。

‌注意事项‌：

试剂禁止反复冻融，分装为小体积 - 20℃保存，融化后冰上放置不超过 2 h

所有耗材必须无 DNase/RNase，吸头一次性使用，废液、废弃 PCR 管 121℃高压灭菌后丢弃

阳性质粒高拷贝，开盖全程在生物安全柜操作，防止气溶胶污染实验室

试剂盒仅限科研检测，禁止人、临床样本检测

试剂盒过期、试剂浑浊、变色禁止使用

若大量样本出现阴性对照带污染，立即更换全新试剂盒，彻底紫外消毒实验台面、移液器

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