抗坏血酸过氧化物酶(APX)测试盒

商品属性：

商品介绍：

APX是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗坏血酸代谢的关键酶之一。APX具有多种同功酶，分别定位于叶绿体、胞质、线粒体、过氧化物和乙醛酸体，以及过氧化体和类囊体膜上。APX 催化H2O2氧化AsA，是植 AsA 的主要消耗者。APX的活性直接影响到AsA的含量，APX与AsA具有一定的负相关性。

测定原理：

APX 催化催化H2O2氧化AsA，通过测定AsA氧化速率，来计算得APX活性。

自备仪器用品：

低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、移液枪、研钵、冰和蒸馏水。
检测原理：

酶促清除过氧化氢原理：APX 以抗坏血酸 (ASA) 为电子供体，催化过氧化氢 (H₂O₂) 还原分解为水；同时抗坏血酸被氧化生成单脱氢抗坏血酸。

底物消耗动力学原理：反应过程中抗坏血酸底物不断被消耗；抗坏血酸在 290 nm 紫外波长具有特征光吸收。

紫外速率检测原理：连续监测 290 nm 波长吸光度下降速率；吸光度下降速度与 APX 酶活性成正比。

空白干扰扣除原理：不加 H₂O₂底物的对照管，扣除样品中非酶促造成抗坏血酸氧化损耗；计算酶活性。
样本前处理方法：

血清/血浆样本采集：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20°C，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻处理：直接检测。

植物组织样本取样：称取0.1g样本，加入1mL提取液，研磨成匀浆提取：80℃水浴30min，期间振荡2-3次离心：8000g 4℃离心10min，取上清，用提取液定容至10mL，待测

食品/饲料样本取样：称取0.1g样本，加入1mL提取液，研磨成匀浆提取：80℃水浴30min，期间振荡2-3次离心：8000g 4℃离心10min，取上清，用提取液定容至10mL，待测

细胞/微生物样本收集：先收集微生物或细胞到离心管内，离心后弃上清破碎：按照微生物或细胞数量（10⁴个）:提取液体积(mL)为500~1000:1的比例（建议500万微生物或细胞加入1mL提取液），超声波破碎微生物或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：8000g 4℃离心10min，取上清，待测

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测定操作步骤：

操作仪器预热：可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到620nm和510nm，蒸馏水调零标准曲线绘制：

直链淀粉标准曲线：将直链淀粉标准品稀释成0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL系列浓度，各取0.1mL，加入0.9mL碘试剂，摇匀后测定620nm和510nm处的吸光值，绘制标准曲线

支链淀粉标准曲线：将支链淀粉标准品稀释成0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL系列浓度，各取0.1mL，加入0.9mL碘试剂，摇匀后测定620nm和510nm处的吸光值，绘制标准曲线样本测定：取0.1mL待测样本，加入0.9mL碘试剂，摇匀后测定620nm和510nm处的吸光值

ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度