商品属性：
产品名称 | 顺乌头酸酶(ACO)测试盒 | 货号 | YSH3402 |
规格 | 100管/96样、50管/50样 | 检测方法 | 微量法、紫外分光光度法 |
商品介绍：
顺乌头酸酶（aconitase），三羧酸循环中的酶，催化柠檬酸转变为异柠檬酸。柠檬酸本身不易氧化，在顺乌头酸酶作用下，通过脱水与加水反应，使羟基由β碳原子转移到α碳原子上，生成易于脱氢氧化的异柠檬酸，为进一步的氧化脱羧反应作准备。
测定原理
ACO催化柠檬酸转化成异柠檬酸，异柠檬酸氧化脱羧将NAD+ 还原生成NADH，导致340nm处光吸收上升。
需自备的仪器和用品
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
检测原理：
异构化反应：ACO催化柠檬酸异构化为异柠檬酸
偶联酶法：生成的异柠檬酸在异柠檬酸脱氢酶的作用下氧化脱羧，同时还原NADP⁺为NADPH
检测波长：在340nm波长下测定NADPH的吸光度变化，吸光度上升速率与ACO活性正相关
三羧酸循环：ACO是三羧酸循环的关键酶，其活性可反映三羧酸循环的运转效率
样本前处理方法：
血清/血浆样本
血清制备：室温自然凝固15-20分钟，2000-3000转/分离心20分钟，取上清液。
血浆制备：使用EDTA或肝素钠抗凝，采血后轻轻颠倒混匀，同上述条件离心取上清。
保存：4℃可保存3天，-20℃可保存1个月，避免反复冻融。
组织样本
称取约0.1g组织，按1:9比例加入预冷的提取液（如0.1g组织+0.9mL提取液），冰浴匀浆。
10000转/分4℃离心10分钟，取上清液待测，剩余样本-20℃保存。
细胞样本
收集细胞沉淀，加入提取液（10^6个细胞/1mL提取液），吹打混匀后超声破碎（冰浴，功率20%，超声3s/间隔10s，重复30次）。
10000转/分4℃离心10分钟，取上清液待测。
尿液样本
取新鲜尿液，2000转/分离心10分钟，取上清液。
若尿液浑浊，需用0.22μm滤膜过滤后再检测。
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测定操作步骤：
比色法/COD-PAP法/分光光度法操作仪器预热：分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到500~520nm，蒸馏水调零试剂配制：
试剂二：临用前加入10mL蒸馏水充分溶解备用
试剂三：临用前加入20mL蒸馏水充分溶解备用样本测定：
试剂名称(μL) 空白管 测定管
蒸馏水/样本 100 100
试剂一 700 700
试剂二 100 100
试剂三 100 100
混匀后37℃水浴15min，记录500~520nm处的吸光值A空白和A测定标准曲线绘制：将FC标准品稀释成0、0.031、0.063、0.125、0.25、0.5、1μmol/L系列浓度，同样处理，测定500~520nm处的吸光值，绘制标准曲线
ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：
从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃
设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度
关键字： 顺乌头酸酶;ACO;测试盒;
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