乙酰辅酶A测试盒

商品属性：

商品介绍：

乙酰辅酶A广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。是生物体能源物质代谢过程中产生的一种重要的中间代谢产物。在体内能源物质代谢中是一个枢纽性的物质。糖、脂肪、蛋白质三大营养物质通过乙酰辅酶A汇聚成一条共同的代谢通路-三羧酸循环和氧化磷酸化，经过这条通路彻底氧化生成二氧化碳和水，释放能量用于ATP合成。此外，乙酰辅酶A是合成脂肪酸，酮体，胆固醇及其衍生物等生理活性物质的前体物质。

测定原理

苹果酸脱氢酶可催化苹果酸和NAD生成草酰乙酸和NADH。柠檬酸合酶可催化乙酰辅酶A和草酰乙酸生成柠檬酸和辅酶A。利用苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶的偶联反应，乙酰辅酶A含量和NADH的生成速率成正比，340nm下吸光值的上升速率反应了乙酰辅酶A含量的高低。

需自备的仪器和用品

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
检测原理：

草酰乙酸‑柠檬酸合酶偶联 DTNB 法：乙酰‑CoA 与草酰乙酸在柠檬酸合酶作用下生成柠檬酸 + CoA‑SH；巯基与 DTNB 显色，412 nm 定量。

正向 NADH 紫外偶联法：乙酰‑CoA 经偶联酶系列反应生成 NADH，340 nm 吸光度上升对应乙酰‑CoA 含量。

巯基荧光探针终点法：释放 CoA‑SH，荧光探针结合巯基产生荧光，荧光强度定量乙酰‑CoA。

羟胺‑铁离子显色法：乙酰‑CoA 与羟胺反应生成异羟肟酸，再与三价铁生成红棕色复合物，540 nm 比色。
样本前处理方法：

血清/血浆样本采集：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20°C，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻处理：直接检测。

植物组织样本取样：称取0.1g样本，加入1mL提取液，研磨成匀浆提取：80℃水浴30min，期间振荡2-3次离心：8000g 4℃离心10min，取上清，用提取液定容至10mL，待测

食品/饲料样本取样：称取0.1g样本，加入1mL提取液，研磨成匀浆提取：80℃水浴30min，期间振荡2-3次离心：8000g 4℃离心10min，取上清，用提取液定容至10mL，待测

细胞/微生物样本收集：先收集微生物或细胞到离心管内，离心后弃上清破碎：按照微生物或细胞数量（10⁴个）:提取液体积(mL)为500~1000:1的比例（建议500万微生物或细胞加入1mL提取液），超声波破碎微生物或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：8000g 4℃离心10min，取上清，待测

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测定操作步骤：

操作仪器预热：可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到620nm和510nm，蒸馏水调零标准曲线绘制：

直链淀粉标准曲线：将直链淀粉标准品稀释成0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL系列浓度，各取0.1mL，加入0.9mL碘试剂，摇匀后测定620nm和510nm处的吸光值，绘制标准曲线

支链淀粉标准曲线：将支链淀粉标准品稀释成0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL系列浓度，各取0.1mL，加入0.9mL碘试剂，摇匀后测定620nm和510nm处的吸光值，绘制标准曲线样本测定：取0.1mL待测样本，加入0.9mL碘试剂，摇匀后测定620nm和510nm处的吸光值

ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度