背景及概述[1]
拓扑异构酶是催化DNA的拓扑异构体之间转变的酶。该酶可以改变DNA拓扑异构体的连环数(linkingnumber)，即L值。拓扑异构酶可分为两类，Ⅰ类能使双链超螺旋DNA转变成松弛形环状DNA，每一次反应可使L值增加1。Ⅱ类则可使松弛环状DNA转变成超螺旋形DNA，每次作用，可使L值减少2，又称促旋酶。在多种拓扑异构酶中，牛痘病毒拓扑异构酶I(VacciniatopoisomeraseI，VTopoI)是目前已知的最简单、分子质量最小、惟一一种存在于病毒内的I型拓扑异构酶，其由314个氨基酸残基构成，基因大小仅有945bp。
有研究建立了牛痘病毒拓扑异构酶(Vacciniatopoisomerase)的原核表达体系及纯化方法，以获得高活性、高纯度的牛痘病毒拓扑异构酶。优化并人工合成牛痘病毒拓扑异构酶的全基因序列，构建牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ的原核表达载体(pET28a/TOPO)并转化E.coliBL21Star(DE3)菌株，优化其诱导表达条件，表达蛋白经Talonhis-tagpurificationresin螯合层析柱纯化，用SDS-PAGE鉴定纯化效果，借助酶切质粒pLLP-OmpA检测纯化蛋白的活性。结果显示转化pET28a/TOPO的E.coliBL21Star(DE3)特异地表达了牛痘病毒拓扑异构酶蛋白，诱导条件为30℃下以0.5mmol/LIPTG诱导12h。该蛋白经钴离子螯合层析柱纯化后，SDS-PAGE电泳结果显示其为分子质量36ku的蛋白。酶切和冻融试验结果表明，该酶具有高活性和高稳定性。因此成功构建了牛痘病毒拓扑异构酶的原核表达和纯化体系，为后续拓扑异构酶的应用研究奠定了基础。
主要参考资料
[1] 协和医学词典
[2] 牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ的原核表达与纯化